siRNA和shRNA简介

小或短干扰RNA（small/short interfering RNA, siRNA）是一类20-25个核苷酸长度的双链RNA分子。小发卡或短发卡RNA（a small hairpin RNA or short hairpin RNA, shRNA）是一段具有紧密发卡环（tight hairpin turn）的RNA序列。

图 1. siRNA和shRNA结构。（A） siRNAs是短的RNA双链，在3‘端有两个碱基的游离。 （B） shRNA由正义链和反义链通过环状序列隔开共同组成。（C） shRNA 构建用于插入表达载体。

 

图 2. RNAi介导的基因沉默机制

 

 

通常我们研究RNAi有三种策略：

1、直接合成针对靶基因的siRNA，通过转染的方法使之进入细胞内，参与到RNAi途径，发挥使靶基因沉默的效应。
2、构建shRNA的质粒表达载体，转染细胞，在细胞内转录生成shRNA,利用细胞内的Dicer酶，生成相应的siRNA，发挥RNAi作用。
3、构建shRNA的病毒表达载体，常用的病毒载体有腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体等。

在研究RNAi之前，设计针对目的基因的siRNA（小干扰RNA）成为至关重要的一步，下面我们就来看一下siRNA设计要遵循哪些原则

    siRNA设计原则 ①  选择19-29个核苷酸的siRNA序列
②  识别的理想位点包括靶mRNA序列中的AA二核苷酸区和3'端19个核苷酸的位点，通常情况下，siRNA与3’端为dUdU或者dTdT的游离碱基的mRNA结合效率更高
③  在不同位点选择至少2-4个靶序列，避免设计含有4-6个poly（T）的序列
④  siRNA序列 的G/C含量在30%～52%
⑤  确保siRNA序列与其他编码序列没有同源性

 

遵循这些设计原则，接下来我们就开始设计siRNA。siRNA有很多在线设计工具。下面列出了4个siRNA设计，我们以小鼠的Map2k1在thermofisher上设计siRNA 为例。


siDirect设计网站
http://sidirect2.rnai.jp
DSIR设计网站  
http://biodev.extra.cea.fr/DSIR/DSIR.html
invivogen设计网站 
http://www.invivogen.com/sirnawizard/siRNA.php
thermofisher设计网站https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/setOption.do?designO
我们通过NCBI找到小鼠Map2k1有一个转录本NM_008927.4，将NM号或者CDS序列复制到thermofisher网站中，如下图所示


 
针对每一个靶基因选择靶点相差25bp以上的4星半以上的至少3条序列。随后将siRNA片段进行转染来找出一条沉默效率最高的siRNA 序列，想要更深入进行基因功能研究也可以使用上文提到的构建shRNA病毒表达载体。
 

千辛万苦设计好了siRNA

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