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实例分享｜荧光素酶的应用
人阅读 发布时间：2019-08-16 10:35
上一篇，我们介绍了荧光素酶应用的两个方面：转录因子结合位点与启动子活性分析、miRNA 与其靶点相关分析，本篇就通过实例来详解一下这两个应用
经典应用案例一
LncRNA 转录因子结合位点与启动子活性分析（lncRNA 结合蛋白质）
论文来源: Wang, P., et al. (2014). "The STAT3-binding long noncoding RNA lnc-DC controls human dendritic cell differentiation." Science 344 (6181): 310-313.
本文是曹雪涛实验室在 2014 年发表在 Science 上一篇研究性论文。作者通过芯片鉴定出 DC (树突状细胞) 发育相关的一个 lncRNA，命名为 lnc-DC。同时高通量测序也发现了这条差异 lncRNA 的存在。进而作者通过 Northern Blot 验证了这条 lnc-DC。由于 lnc-DC 极其特异和稳定地高表达在 DC 发育过程的某一时期，所以作者假设 lnc-DC 可能是和表观遗传学调控事件相关的。为了验证这一假设，作者通过染色体免疫沉淀结合测序的技术 - CHIP-seq 和 qPCR 发现 lnc-DC 的转录起始位点（TSS）附近富集了 Pol II、H3K4me3 和 H3K27ac 等蛋白（下图 A），提示 DC 发育过程中表观遗传学变化与 lnc-DC 的转录增强事件相对应。进而作者通过序列分析发现在 lnc-DC 的转录起始位点附近（+44-+50）存在一个经典的 PU.1 结合位点。作者假设 PU.1 参与了 lnc-DC 的特异性表达。于是作者设计了如下实验进行了进一步的验证（下图 B）。
作者把 lnc-DC 的启动子区段（-1447-+223）及其不同的突变体版本分别克隆到 F-Luciferase 表达框上游，然后和转录因子 PU.1 表达质粒或者空载体（Vector）共同转染到模式细胞系 HEK-293T，通过测量荧光强度的变化间接反应转录活性的高低。最终证明转录因子 PU.1 通过经典结合位点（+44-+50）介导了 lnc-DC 在 DC 发育过程中的特异表达。
经典应用案例三
LncRNA 通过吸附 miRNA 调控其生理功能 (ceRNA 机制)
论文来源: Kallen, A. N., et al. (2013). "The imprinted H19 lncRNA antagonizes let-7 microRNAs." Molecular Cell 52 (1): 101-112.
H19 属于非常保守的印记基因家族，在胚胎发育和生长方面发挥极其重要的功能。为了进一步研究 lncRNA H19 的功能，作者通过信息学分析发现 H19 包含 let-7 的 4 个结合位点。于是作者推测 H19 可能会影响 let-7 发挥作用。
为了验证这一预测，研究者把 4 个 let-7 潜在结合位点串联起来克隆到 RLuc 的 3’UTR 区。然后先后跟 let-7 的抑制型载体（下图 A 和 B）和过表达载体（下图 C）分别共转染到细胞系检测荧光素酶的活性，证明 Let-7 的结合位点确实存在且发挥功能。进一步证明 H19 通过 RNA sponge 的机制影响 let-7 家族靶基因的表达参与肌肉发育调控过程。
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经典应用案例一
LncRNA 转录因子结合位点与启动子活性分析（lncRNA 结合蛋白质）
论文来源: Wang, P., et al. (2014). "The STAT3-binding long noncoding RNA lnc-DC controls human dendritic cell differentiation." Science 344 (6181): 310-313.
本文是曹雪涛实验室在 2014 年发表在 Science 上一篇研究性论文。作者通过芯片鉴定出 DC (树突状细胞) 发育相关的一个 lncRNA，命名为 lnc-DC。同时高通量测序也发现了这条差异 lncRNA 的存在。进而作者通过 Northern Blot 验证了这条 lnc-DC。由于 lnc-DC 极其特异和稳定地高表达在 DC 发育过程的某一时期，所以作者假设 lnc-DC 可能是和表观遗传学调控事件相关的。为了验证这一假设，作者通过染色体免疫沉淀结合测序的技术 - CHIP-seq 和 qPCR 发现 lnc-DC 的转录起始位点（TSS）附近富集了 Pol II、H3K4me3 和 H3K27ac 等蛋白（下图 A），提示 DC 发育过程中表观遗传学变化与 lnc-DC 的转录增强事件相对应。进而作者通过序列分析发现在 lnc-DC 的转录起始位点附近（+44-+50）存在一个经典的 PU.1 结合位点。作者假设 PU.1 参与了 lnc-DC 的特异性表达。于是作者设计了如下实验进行了进一步的验证（下图 B）。
作者把 lnc-DC 的启动子区段（-1447-+223）及其不同的突变体版本分别克隆到 F-Luciferase 表达框上游，然后和转录因子 PU.1 表达质粒或者空载体（Vector）共同转染到模式细胞系 HEK-293T，通过测量荧光强度的变化间接反应转录活性的高低。最终证明转录因子 PU.1 通过经典结合位点（+44-+50）介导了 lnc-DC 在 DC 发育过程中的特异表达。
经典应用案例二
LncRNA 通过吸附 miRNA 调控靶基因 mRNA 的表达 (ceRNA 机制)
论文来源: Cesana, M., et al. (2011). "A long noncoding RNA controls muscle differentiation by functioning as a competing endogenous RNA." Cell 147 (2): 358-369.
作者通过表达分析发现了一条肌肉发育相关的 lncRNA---lnc-MD1. 前期功能研究发现 lnc-MD1 可以调控肌肉分化的时间。信息学分析发现这条肌肉特异的 lncRNA 上包含 36 个 miRNA 的结合位点。如果只考虑肌肉发育相关的 miRNA 和基因，36 个候选 miRNA 里面只剩下 miR-133 和 miR-135。作者通过荧光素酶实验进行了验证。首先作者把野生型及其缺失 miR-133 和 miR-135 结合位点的 Lnc-DC1 克隆到进 R-Luc 的 3’UTR，然后分别与表达 miR-133 和 miR-135 前体的质粒共同转染到细胞进行荧光素酶活性检测（下图 A 和 B）。证明 lnc-MD1 缺失存在 miR-133 和 miR-135 的结合位点。
进一步的信息学预测，miR-133 和 miR-135 分别靶向两个基因 - MAML1 和 MEF2C。同样，作者还是通过荧光素酶实验进行验证。研究者把 MAML1 和 MEF2C 的 3’UTR （WT）和 miRNA 结合位点缺失突变体（-mut）分别克隆在 RLuc 表达框的下游，然后和 miRNA 过表达载体共转染细胞进行酶活测定。结果显示 miR-133 和 miR-135 确实分别靶向了 MAML1 和 MEF2C 两个基因（下图 C）。最后的模型是 lnc-MD1 通过 ceRNA 机制吸附 miR-133 和 135，正向调控了 MAML1 和 MEF2C 的表达，参与调控肌肉发育。
LncRNA 通过吸附 miRNA 调控靶基因 mRNA 的表达 (ceRNA 机制)
论文来源: Cesana, M., et al. (2011). "A long noncoding RNA controls muscle differentiation by functioning as a competing endogenous RNA." Cell 147 (2): 358-369.
作者通过表达分析发现了一条肌肉发育相关的 lncRNA---lnc-MD1. 前期功能研究发现 lnc-MD1 可以调控肌肉分化的时间。信息学分析发现这条肌肉特异的 lncRNA 上包含 36 个 miRNA 的结合位点。如果只考虑肌肉发育相关的 miRNA 和基因，36 个候选 miRNA 里面只剩下 miR-133 和 miR-135。作者通过荧光素酶实验进行了验证。首先作者把野生型及其缺失 miR-133 和 miR-135 结合位点的 Lnc-DC1 克隆到进 R-Luc 的 3’UTR，然后分别与表达 miR-133 和 miR-135 前体的质粒共同转染到细胞进行荧光素酶活性检测（下图 A 和 B）。证明 lnc-MD1 缺失存在 miR-133 和 miR-135 的结合位点。
进一步的信息学预测，miR-133 和 miR-135 分别靶向两个基因 - MAML1 和 MEF2C。同样，作者还是通过荧光素酶实验进行验证。研究者把 MAML1 和 MEF2C 的 3’UTR （WT）和 miRNA 结合位点缺失突变体（-mut）分别克隆在 RLuc 表达框的下游，然后和 miRNA 过表达载体共转染细胞进行酶活测定。结果显示 miR-133 和 miR-135 确实分别靶向了 MAML1 和 MEF2C 两个基因（下图 C）。最后的模型是 lnc-MD1 通过 ceRNA 机制吸附 miR-133 和 135，正向调控了 MAML1 和 MEF2C 的表达，参与调控肌肉发育。
经典应用案例三
LncRNA 通过吸附 miRNA 调控其生理功能 (ceRNA 机制)
论文来源: Kallen, A. N., et al. (2013). "The imprinted H19 lncRNA antagonizes let-7 microRNAs." Molecular Cell 52 (1): 101-112.
H19 属于非常保守的印记基因家族，在胚胎发育和生长方面发挥极其重要的功能。为了进一步研究 lncRNA H19 的功能，作者通过信息学分析发现 H19 包含 let-7 的 4 个结合位点。于是作者推测 H19 可能会影响 let-7 发挥作用。
为了验证这一预测，研究者把 4 个 let-7 潜在结合位点串联起来克隆到 RLuc 的 3’UTR 区。然后先后跟 let-7 的抑制型载体（下图 A 和 B）和过表达载体（下图 C）分别共转染到细胞系检测荧光素酶的活性，证明 Let-7 的结合位点确实存在且发挥功能。进一步证明 H19 通过 RNA sponge 的机制影响 let-7 家族靶基因的表达参与肌肉发育调控过程。
经典应用案例四
circRNA 通过吸附 miRNA 调控其靶基因 mRNA 的表达 (ceRNA 机制)
论文来源: Zheng, Q., et al. (2016). "Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs." Nat Commun 7: 11215.
环状 RNA (circRNA) 是非编码 RNA 领域一类新的明星分子，研究者对其功能还知之甚少。
本文中，作者鉴定出一个表达量较高的环状 RNA 分子 - circHIPK3. circHIPK3 来源于基因 HIPK3 第二个外显子。RNAi 干扰 circHIPK3 可以影响细胞的生长。为了进一步研究其机制，作者通过序列分析发现 circHIPK3 含有一些列 miRNA 结合位点。为了从中筛选出真正的 miRNA，作者构建了基于荧光素酶的筛选系统 --- 把 circHIPK3 构建到 Luciferase 的 3’UTR 区域，然后分别与 424 个 miRNA mimics 共转染到模式细胞系 HEK-293T 内进行筛选验证，最终作者筛选出 9 个候选的 miRNA。通过功能试验和共表达分析进一步验证得到 mir-124 是阳性候选 miRNA。最终作者证明 circHIPK3 通过吸附 miR-124 正向调控了其靶基因 IL6R 和 DLX2 的表达，影响了细胞的生长。
circRNA 通过吸附 miRNA 调控其靶基因 mRNA 的表达 (ceRNA 机制)
论文来源: Zheng, Q., et al. (2016). "Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs." Nat Commun 7: 11215.
环状 RNA (circRNA) 是非编码 RNA 领域一类新的明星分子，研究者对其功能还知之甚少。
本文中，作者鉴定出一个表达量较高的环状 RNA 分子 - circHIPK3. circHIPK3 来源于基因 HIPK3 第二个外显子。RNAi 干扰 circHIPK3 可以影响细胞的生长。为了进一步研究其机制，作者通过序列分析发现 circHIPK3 含有一些列 miRNA 结合位点。为了从中筛选出真正的 miRNA，作者构建了基于荧光素酶的筛选系统 --- 把 circHIPK3 构建到 Luciferase 的 3’UTR 区域，然后分别与 424 个 miRNA mimics 共转染到模式细胞系 HEK-293T 内进行筛选验证，最终作者筛选出 9 个候选的 miRNA。通过功能试验和共表达分析进一步验证得到 mir-124 是阳性候选 miRNA。最终作者证明 circHIPK3 通过吸附 miR-124 正向调控了其靶基因 IL6R 和 DLX2 的表达，影响了细胞的生长。
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