心肌肥厚最初是对生理和病理超负荷的适应性反应。它的一个关键过程是对蛋白质周转代谢的适应，即蛋白质合成与降解之间的平衡。控制蛋白质降解的主要机制是泛素-蛋白酶体系统(UPS)，它对细胞凋亡、信号转导和转录活性的调控等许多细胞过程都具有重要作用。

 

细胞分裂周期20同源物(CDC20，也称Fizzy)是促后期酶复合物(APC)的激活物，属于E3泛素连接酶复合物。研究表明，CDC20通过靶向不同的信号传导介质，在细胞凋亡和肿瘤发生中发挥重要作用。然而，CDC20在心肌肥厚过程中的功能作用以及CDC20的分子靶点仍有待确定。

 

近日，大连医科大学李汇华教授团队在心肌肥厚治疗方面取得重大成果。并在生物医学一区杂志《Theranostics》（IF=8.537），研究结果揭示了CDC20在调节心肌肥厚方面的新作用，它可以通过靶向LC3泛素化和蛋白酶体降解调控自噬通量。并提示抑制CDC20可能是治疗肥厚性疾病的潜在治疗靶点。

 

 

 

值得一提的是，文中使用了汉恒一直推荐的【自噬研究的“黄金标准”】

 

即汉恒生物mRFP-GFP-LC3自噬双标腺病毒

肥厚刺激心肌细胞中CDC20的上调



 

(A)第3天和第7天血管紧张素ii灌注小鼠心脏中CDC20基因表达的微阵列分析(n=3)。

(B)第3天和第7天血管紧张素ii灌注小鼠心脏CDC20表达的qPCR分析(n=3)。

(C和D) CDC20新生大鼠心肌细胞的蛋白质水平(3)治疗血管紧张素ⅱ(Ang II, 100海里)在不同时间点(n = 4)。

(E)主动脉横缩(TAC) 4周后心脏CDC20 mRNA表达(n=3)。

(F) TAC 4周后心脏CDC20蛋白表达情况(n=3)。


CDC20的下调抑制了心肌细胞肥大反应


 

(A)新生大鼠心肌细胞感染腺病毒siCDC20或siControl后CDC20免疫印迹分析(n=3)。

(B)代表图像双重免疫染色(红色α-actinin,蓝色表示DAPI)经过24小时PE (100 nM)处理后(左)。规模:50μm。心肌细胞表面积的定量(n= 3,150个细胞，每个实验计数;右)。

(C) qPCR分析心房利钠肽(ANP)、脑利钠肽(BNP)和β-myosin重链(β-MHC) mRNA水平基本医疗待遇(B)中描述(n = 3)。

(D)按(B)方法处理的AKT、ERK1/2、p38和GAPDH的免疫印迹分析(n=3);* P < 0.05， ** P < 0.01;P < 0.05, P < 0.01 vs.Ad-siRNA-control + PE。


CDC20的下调在体内抑制肥大


 

(A)注射rAAV9-siZsGreen或rAAV9-siCDC20的野生型(WT)小鼠假手术或TAC持续5周。超声心动图评价射血分数(EF%)和分数缩短(FS%) (n=6)。

(B)心脏切片H&E染色(上图)。标尺0.5厘米。心脏重量与胫骨长度(HW/TL)和体重(HW/BW)(较低)之比(n=6)。

(C)心脏切片用tritc标记的小麦胚芽凝集素(WGA，上图)染色。比例尺:10μm。心肌细胞相对横截面积的量化(每颗心脏有6,200个细胞;较低的面板)。

(D) qPCR分析心房利钠肽(ANP)、脑利钠肽(BNP)和β-myosin重链(β-MHC)的mRNA水平rAAV9-siZsGreen——的心

raav9 - sicdc20在假手术或TAC后治疗小鼠(n=6)。

(E)室段马松三色染色(上)和DHE染色(中)的代表性图像。酒吧规模:50μm。定量相对纤维化面积和ROS荧光强度(n=6，较低)。

(F)心脏样本中p-AKT、AKT、p-ERK1/2、ERK1/2、NOX4和GAPDH的免疫印迹分析(n=6)。* P < 0.05， ** P < 0.01;P < 0.05, P < 0.01;rAAV9-siZsGreen plus TAC组。



CDC20调节自噬通量和LC3的稳定性



 

(A)免疫荧光显示PE和/或si-CDC20治疗后的自噬通量。比例尺:40μm (n = 3)。

(B)免疫荧光显示PE和/或CDC20治疗后的自噬通量(n=3)。

(C)具有代表性的Western blot检测转染siCDC20和磷酸盐缓冲盐水或PE处理72小时后LC3 I/II的表达(n=3)。

(D) CDC20转染后，经磷酸盐缓冲盐水或PE处理72小时后，具有代表性的Western blot表达LC3 I/II (n=3)。

(E)在假手术或TAC后rAAV9-siZsGreen-和raav9 - sicdc20处理的小鼠心脏样本中，代表性的Western blot表达LC3 I/II。* P < 0.05 vs. sham;与rAAV9-siZsGreen + TAC组比较，P < 0.05 (n=6)。

(F)假手术或TAC后，rAAV9-ZsGreen-和raav9 - cdc20处理小鼠心脏样本中具有代表性的Western blot表达LC3 I/II和GAPDH (n=6)。* P < 0.05， ** P < 0.01;P < 0.05。



CDC20与LC3相互作用，促进LC3泛素化和蛋白酶体降解




 

(A) Western blot显示co-IP表达LC3 I/II。

(B) Western blot检测CDC20突变蛋白(标记为Myc)和LC3 I/II的表达。

(C) CDC20结构域示意图及体外结合实验总结。

(D、E)感染siRNA-control、siRNA-CDC20或感染Ad-GFP、Ad-CDC20, MG132预处理6小时后提取的裂解物，用抗lc3免疫沉淀。采用抗泛素(Ub)和抗cdc20抗体Western blot检测泛素结合的LC3。显示相应蛋白在全细胞裂解液中的表达的输入。

(F)用抗泛素(Ub) Western blot检测泛素结合的LC3(左)。显示相应蛋白在全细胞裂解液中的表达的输入(右)。

(G)体外CDC20泛素化LC3。在GST-E1、His6-E2、GFP-CDC20(全长1-499 aa)、GFP-CDC20(168-499 aa)和GFP-CDC20(1-476 aa)存在和缺失的情况下，对标记CDC20进行E3泛素连接酶活性检测。用抗泛素抗体分析蛋白印迹。(H和I)基本医疗感染了腺病毒Ad-GFP和Ad-CDC20或siRNA-control siRNA-CDC20然后接受(CHX 10μM)和/或MG132(10μM)和收获在指定的时间点。各组LC3蛋白水平的代表性免疫印迹分析。



LC3的下调逆转了体外CDC20缺失后心肌细胞大小的减少



 

(A)代表图像双重免疫染色α-actinin(绿色)的NRCMs转染siRNA-CDC20或siRNA-control有或没有Ad-siLC3治疗24小时后和二次刺激(左)。规模50μm。肌细胞表面积的定量(右)(n=3)。

(B)经Ang II刺激24小时后，感染siRNA-control或siRNA-CDC20的p-AKT、AKT、p-ERK1/2、ERK1/2、NOX4、LC3 I/II和GAPDH的代表性Western blot分析(n=3)。

(C)肥厚中CDC20和lc3依赖自噬之间的功能联系。** P < 0.01 vs.生理盐水;与生理盐水比较，P < 0.05, P < 0.01
 

综上所述，研究发现CDC20是一种病理上心肌肥厚和功能障碍的新型调节剂。

 

CDC20的下调改善了肥厚性重构，但CDC20的过表达在细胞和动物模型中加剧了这种反应。结果进一步揭示 CDC20直接与LC3结合，促进LC3泛素化和蛋白酶体降解，从而抑制自噬。

然而，LC3的下调或自噬的抑制逆转了CDC20缺失的抗增生性作用，表明CDC20的下调通过稳定LC3抑制肥大。因此，研究人员的数据为CDC20、lc3依赖的自噬和肥厚之间可能的联系提供了一个新的机制，并揭示了治疗肥厚性疾病的潜在治疗靶点。