实验中用的比较广泛的除了慢病毒，还有腺病毒和腺相关病毒，熟练的掌握这几类病毒包装的实验技能是至关重要的。具体实验中要根据个人目的，选择合适的载体系统，不然就白费功夫了。

 

由于腺病毒和腺相关病毒包装过程比较类似，这次就通过以往的病毒包装经验给大家做一个完整介绍。

 

首先，我觉得很有必要给大家普及一下常用的这三种病毒的各自特点，如下图所示。

图1： 三种病毒的比较

 

腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV) 是简单的非病原单链DNA，为无包膜的单链线状DNA病毒，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。基因组约4800bp，编码两个末端的反向重复序列(ITR) 中的cap和rep基因。

 

ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用。cap基因编码病毒衣壳蛋白，rep基因参与病毒的复制和整合。AAV能感染多种细胞，rep基因产物存在时，病毒DNA很容易整合到人类第19号染色体。

图2： AAV 基因组结构

 

与其他载体病毒相比，腺相关病毒的特点：

1. 安全性高，目前未发现对人体致病；

    

2. 免疫原性低，很少有感染上的细胞之后被免疫系统所清除；

    

3. 宿主范围广，并可感染非分裂细胞；

    

4. AAV载体可将外源基因定点整合到人类19号染色体长臂，基因表达稳定；

    

5. AAV是一种无包膜病毒，对各种理化处理稳定，易于分离纯化；

    

6. 特异性强：不同的血清型对不同的脏器有较高的识别及感染能力。

 

研究发现，AAV具有多种血清型，各种不同血清型的AAV载体的主要区别是衣壳蛋白（cap基因）不同，因此针对不同的组织和细胞的转染效率存在差异。不同的血清型的AAV对不同组织器官或者细胞的亲和性不同，建议根据不同需求选择相应的血清型，见下表。

 

不同血清型AAV对细胞组织器官的亲和性

 

腺相关病毒包装过程：

一、细胞传代

将5×10⁶个293T对数生长期细胞分至含9ml 10%胎牛血清的DMEM培养基中进行10cm Dish传代培养，放入37℃培养箱，过夜孵育16-24h。病毒包装前融合率80%。

 

二、转染

1. 将质粒、PEI、Opti-MEM培养基于室温静置5min。

    

2. 取7µg目的质粒、7µg AAV 载体质粒、14µg 辅助质粒于1.5ml EP管中，加入84µg PEI后，补齐Opti-MEM至1ml，震荡混匀，室温静置20min。

    

3. 将1ml DNA/PEI复合物逐滴加入含单层细胞的培养皿中，轻轻混匀，放入37℃培养箱孵育6h或过夜培养。

    

4. 更换新鲜培养基，从培养皿边缘缓慢加入，后放入37℃培养箱内培养。

 

三、AAV 病毒收集

病毒颗粒同时存在于包装细胞和培养上清中，相对来说，上清内病毒颗粒较少，因此主要收集细胞内的病毒颗粒。

 

1. 准备一个干冰乙醇浴（将乙醇倒入装有干冰的泡沫盒即可，也可用液氮替代干冰乙醇浴）和37℃水浴；

    

2. 培养48-60h后，将产毒的细胞连同部分培养基用细胞刮刀收集，用枪头进行吹打后转移到一个15ml的离心管中。收集细胞时，可使用部分无血清培养基再次吹打培养皿以尽可能减少细胞损失；

    

3. 2000 rpm，离心3min，分离细胞和上清，15皿细胞用10ml lysis buffer重悬，-80℃冰箱保存。

    

四、AAV的纯化（碘克沙醇法）和浓缩

1. 将细胞从-80℃冰箱取出后，在装有干冰的泡沫盒和37℃水浴锅中进行三冻三融，水浴锅中可反复摇晃使快速融化，加氯化镁15ul，核酸酶20ul，混匀后37℃水浴锅中孵育30-40min。

    

2. 6000rpm 4℃离心20min后将含有病毒的上清倒入另一个干净的离心管中（放冰上）。

    

3. 准备碘克沙醇梯度，依次为60%、40%、25%、17%，将指封离心管固定于支架上，分别加入5ml、5.5ml、6.5ml、6.5ml，加入收集到的病毒上清，保证管内无空气，封口；

    

4. 在 600,000 rpm下离心2.5h，以形成密度梯度。收集40%梯度中AAV 颗粒的组分；

    

5. 将收集到的病毒加入PBS稀释后，混匀后加入到超滤离心管内，6000rpm离心，后观察溶液是否出现油状，加PBS稀释进行离心，直至无油状现象出现，获得最后浓缩后的病毒。

图3：AAV包装流程图

 

腺相关病毒包装过程中可能会遇到的问题：

1．特殊大小的细胞怎样处理？

有的细胞特别大或特别小，特别是一些原代细胞，还有的细胞成团无法计数。对于这种细胞，从预实验开始就会有不同。预实验时，保持感染时细胞的密度达到 30~40%，即使细胞没有预定的 3~5×10⁴个/孔的数目。正式实验的细胞密度也控制在差不多的值。对于成团的如胰岛细胞，胚胎干细胞等，注意细胞团的数目和大小，以便以后的实验按比例放大。

 

2．为什么对照病毒和目的基因病毒感染细胞后荧光表达有差异？

这种差异往往出现在过表达慢病毒中，多数过表达慢病毒的元件结构为promoter-gene-GFP 慢病毒，其中 gene 和 GFP 为融合表达形式，当 gene 越大时，融合 GFP 的表达就会越弱，这个是融合表达的一个特点。

 

gene 大小为 0 的时候，即为对照 promoter-GFP 结构，其 GFP 表达最为强烈；在插入目的基因之后，相同病毒用量下，GFP 的荧光要明显弱于对照 GFP 慢病毒。

 

同时 GFP 的强弱也会受到 gene 的功能的影响，比如基因分泌表达，则 GFP 可能随基因分别到细胞外，此时细胞内的 GFP 没有富集，通过显微镜观察时就非常弱，或者几乎难以看到，而对照的 GFP 却是正常表达的。

 

如果 gene 有膜定位，最终观察到的仅细胞膜上一圈有荧光，其他地方没有荧光，此时荧光也会较弱，对照的 GFP 仍然是正常表达的。

 

3．悬浮细胞如何感染？

一种可以参考的感染方法：首先要保证细胞生长状态良好，最好先进行预感染，感染前按实验设计的组别将细胞按预定的数量和体积接种于在 EP 管中，然后加入病毒感染1h后，再将细胞置于孔板中按预实验中的最佳感染条件继续感染。

 

4．安全考虑

病毒操作必须在生物安全水平2级的实验室内进行，穿戴防护衣，使用一次性塑料移液管。固体废物必须经121℃，60min蒸汽灭菌，液体废物经10%终浓度的漂白剂处理后才能弃置。

 

病毒包装是一个大工程，仅仅了解病毒的特征和实验步骤只能说是简单达标，在包装过程中还有很多重要的问题还需要很深入去学习，如病毒滴度的测定。