腺相关病毒

 

腺相关病毒属微小病毒科（parvovirdae），是一种无包膜的线状单链DNA病毒，AAV的基因组约4700bp，包括上下游两个开放读码框架（ORF），位于分别由145个核苷酸组成的2个反向末端重复序列（ITR）之间。

腺相关病毒的优势

AAV是一种复制缺陷型微小病毒，其增殖复制需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。AAV无辅助病毒系统（AAVHelper-FreeSystem）可以在无辅助病毒的条件下生产出重组腺相关病毒。在AAV无辅助病毒系统中，生产具有感染性的AAV病毒颗粒所需的腺病毒基因产物（如：E2A，E4等基因）大部分由pHelper质粒提供，其余的腺病毒基因产物由稳定表达腺病毒E1基因的AAV-293宿主细胞提供。AAV-293细胞是HEK293细胞经过改良腺相关病毒生产能力而衍生出的亚克隆细胞系。野生型AAV基因组由病毒rep和cap基因（分别编码AAV复制和包装相关的基因）及位于两侧的表达和包装必须的顺式作用元件——反向末端重复序列（ITRs）组成。在AAV无辅助病毒系统中，rep和cap基因从病毒载体中被转移到辅助质粒pAAV-RC中，AAVITRs仍位于病毒载体中。在辅助质粒的帮助下，仅需两端的ITR就能将携带的外源片段包装进入腺相关病毒颗粒，因此，rep和cap基因的转移后空出的位置是允许外源基因插入病毒基因组中的最大限度。由于不再需要活的辅助病毒，AAV无辅助病毒系统提供一个更安全，更便利的替代逆转录病毒和腺病毒的基因传递系统。

重组腺相关病毒载体不同血清型

研究发现AAV具有多种血清型，各种不同血清型的AAV载体的主要区别是衣壳蛋白不同，因此对不同的组织和细胞的转染效率存在差异。在包装腺相关病毒时有多种不同的AAV血清型可供选择，建议针对不同组织器官选择相应血清型的AAV病毒，见下表。

组织亲和性	血清型
脑组织，神经组织，中枢神经 （颅内注射，内部脑室注射等，滴度为1012-1013GC/ml，注射量约为1ul左右）	AAV-1: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12768022/ AAV-5: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20179682/ AAV-8: AAV8 vectors  mediate high efficiency gene transfer to the adult mouse brain AAV-9: http://www.researchgate.net/publication/23680435_Intravascular_AAV9_preferentially_targets_neonatal_neurons_and_adult_astrocytes
骨骼肌、心肌 （心肌注射，尾静脉注射等，滴度为108-1010GC/ml，注射量约为5ul左右）	AAV-9: http://www.researchgate.net/publication/24031920_A_myocardium_tropic_adeno-associated_virus_(AAV)_evolved_by_DNA_shuffling_and_in_vivo_selection   AAV1、6、8: http://www.nature.com/nbt/journal/v23/n3/abs/nbt1073.html
心脏（颈静脉注射，心包内注射等，滴度109-1012GC/ml，注射量约为50ul左右，或根据小鼠体重而定）	AAV-9: http://pubmedcentralcanada.ca/pmcc/articles/PMC2988989/;jsessionid%3DEAE7C93CD25B6C0939DD2E920A63BFC2.eider?lang=en-ca   AAV1、6、7、8、9: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2940566/
眼，视网膜 （玻璃体注射，视网膜下注射等，滴度1011-1013GC/ml，注射量约为1ul左右）	AAV2: http://www.medsci.cn/sci/show_paper.asp?id=73dc1807640   AAV1、 2 、5、7、8 、9  : http://www.researchgate.net/publication/5572951_Novel_AAV_serotypes_for_improved_ocular_gene_transfer
肺（尾静脉注射等，滴度1010-1012GC/ml，注射量约为50ul左右）	AAV6: http://cdn.intechopen.com/pdfs/16784/InTech-Comparison_of_aav_serotypes_for_gene_delivery_to_dopaminergic_neurons_in_the_substantia_nigra.pdf AAV1、2、5、6、7、8:  http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21752418
肝脏（尾静脉注射等，滴度1010-1012GC/ml，注射量根据小鼠体重而定）	AAV8:http://www.researchgate.net/publication/38041149_Systematic_Evaluation_of_AAV_Vectors_for_Liver_directed_Gene_Transfer_in_Murine_Models   AAV9:http://www.researchgate.net/publication/24031920_A_myocardium_tropic_adeno-associated_virus_(AAV)_evolved_by_DNA_shuffling_and_in_vivo_selection
肾脏（尾静脉注射等，滴度1010-1012GC/ml，注射量约为20ul左右）	AAV2: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/1440-1681.12037/citedby

 

腺相关病毒的包装

用构建的腺相关病毒表达载体和辅助质粒共转染AAV-293细胞，包装病毒，收集病毒原液，浓缩并纯化后得到病毒浓缩液。

AAV应用实例

小鼠心脏、隔膜、肝脏在心包内注射AAV生长6周后的显微照片。在注射量为2.5*1011vg的情况下，所有血清型均有高效率的心脏基因转移；AAV8和9具有高效的隔膜转换；但是在肝脏中表达都较低。

Dayton RD, et al. The advent of AAV9 expands applications for brain and spinal cordgene delivery. Expert Opin Biol Ther. Jun;12(6):757-66(2012).

 

Balb/C 小鼠注射AAV1-9生长9个月后的荧光素酶活性检测。结果显示，AAV2–5表达范围为5,000–25,000 photons/second/cm2，为低表达组；AAV1,6和8表达范围为15,000–200,000 photons/second/cm2，为中等表达组；AAV7和9表达范围为10,000–1,000,000 photons/second/cm2，为高等表达组。

Zincarelli C, et al. Analysis of AAVserotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemicinjection. Mol Ther. Jun;16(6):1073-80(2008).

 

小鼠心脏、隔膜、肝脏在心包内注射AAV生长6周后的显微照片。在注射量为2.5*1011vg的情况下，所有血清型均有高效率的心脏基因转移；AAV8和9具有高效的隔膜转换；但是在肝脏中表达都较低。

Bish LT, et al. Adeno-associated virus(AAV) serotype 9 provides global cardiac gene transfer superior to AAV1, AAV6,AAV7, and AAV8 in the mouse and rat. Hum Gene Ther. Dec;19(12):1359-68(2008).

小鼠体内AAV转导，结果表明，这两种AAV在小鼠体内虽然不同程度的效率，但有着类似的目标模式进行气道和肺泡上皮转导。体外细胞实验，AAV6在气道上皮细胞具有更高的转导效率；两种AAV在肺泡和细支气管细胞中的转导效率相似，且在气管细胞中均较低，但AAV6仍然比AAV1具有较高的转导效率。

Li W, et al. AAV-6 mediated efficient transductionof mouse lower airways. Virology. Sep 1;417(2):327-33(2011).