文献信息

2024年3月8日，中山大学附属第一医院邓春华、张敏以及华南理工大学施雪涛在《Nature Communications》（IF=16.6）上联合发表题为“Stem Leydig cells support macrophage immunological homeostasis through mitochondrial transfer in mice”的研究论文。本研究主要探讨了SLCs在睾丸急性和慢性炎症中的作用机制，尤其是对巨噬细胞免疫状态的调控及分子机制。作者建立了睾丸缺血再灌注损伤和睾丸衰老两种小鼠模型，并从健康新生鼠中提取的SLCs进行体内睾丸间质移植，或在体外与巨噬细胞共培养。作者观察了SLCs移植对于组织修复、巨噬细胞炎症和男性生殖能力恢复的影响。结果发现，移植的SLCs通过促进内源性LCs修复来恢复睾丸的分泌功能，并形成纳米管主动与睾丸巨噬细胞建立细胞间通讯，将线粒体转运至巨噬细胞中，使其由促炎表型快速转变为抗炎表型，进而发挥睾丸组织修复和抗炎作用，同时显著提高了模型小鼠的生育能力。本文研究结果为治疗与男性不育相关的睾丸损伤提供了新的见解。

汉恒生物有幸为作者提供了线粒体标记工具慢病毒（pCMV-Mito-DsRed-puro），成功标记了小鼠SLCs和骨髓间充质干细胞（BMSCs）中的线粒体；另外，还构建了TRPM7 shRNA慢病毒用以敲低原代SLCs中TRPM7基因的表达。

下面我们一起来看看作者是如何发掘其中的机制：

研究成果

1. SLCs可在急性睾丸缺血再灌注模型中预防生育能力损伤

为探究SLCs在急性睾丸损伤修复中的作用及免疫调节功能，作者建立了小鼠睾丸扭转模型。并从新生小鼠睾丸和骨髓中分离纯化出SLCs和BMSCs（已证明可减轻急性睾丸损伤），经体外培养后移植入模型小鼠睾丸间质。对照组包括假手术组和生理盐水处理组。实验结果显示，相较于SLCs组和假手术组，生理盐水组及BMSCs组小鼠睾丸出现明显萎缩，且生精小管和间质结构异常。SLCs移植显著改善了睾丸结构完整性，提高了睾丸重量与生殖细胞层重量比，促进生殖细胞恢复。通过PNA（精子/单倍体精细胞标记物）和α-SMA（管周肌样细胞标记物）免疫荧光染色，发现SLCs组PNA细胞数量增多，附睾内精子数量、活力提升，且含有大量长尾精子。为评估SLCs对生育能力的影响，进行了体外受精（IVF）实验和小鼠交配实验。结果显示，SLCs组2-细胞胚胎及囊胚形成比例增加，且其小鼠产仔数量多于BMSCs组。这些结果表明，SLCs能在急性睾丸损伤模型中有效恢复组织完整性，改善精子发生过程，显著提升男性生育能力，并且比BMSCs更具治疗潜力。

图1. 缺血再灌注后，SLCs与BMSCs对于睾丸功能的治疗效果

 

  

2. 移植的SLCs主要通过加速内源性LCs的恢复来促进睾酮产生

为了验证移植的SLCs是否能恢复睾丸的激素分泌功能，作者检测了细胞移植28天后各组小鼠的睾酮水平及LHR（黄体生成素受体）阳性LCs比例。结果显示，SLCs组睾酮水平显著高于BMSCs组和生理盐水组，且LHR⁺LCs比例增加。为进一步明确移植细胞对LCs再生的作用，经zsGreen荧光标记追踪细胞发现，移植细胞未发生迁移，且于第7天基本消失。第28天，SLCs^zsGreen组中仅约10% LHR+细胞为zsGreen阳性，表明大部分LCs并非源自外源性SLCs。同时，LHR⁺zsGreen^-与LHR⁺zsGreen⁺细胞分泌的睾酮水平并没有差异，提示内源性SLCs和LCs在睾酮恢复中起主导作用。综上所述，移植的SLCs主要通过加速内源性LCs的恢复来促进睾酮的产生。

图2. 极少数移植的SLCs分化为LCs

 

3. 移植的SLCs抑制早期炎症级联反应

针对睾丸扭转引发的缺血再灌注损伤及其伴随的炎症反应，作者研究了移植细胞是否通过有效抑制早期炎症反应促进内源性LCs再生。研究显示，尽管第1天各组小鼠睾丸中CD45⁺F4/80⁺巨噬细胞比例没有显著差异，但在第3和第7天，SLCs组巨噬细胞数量显著下降，且促炎因子IL-1α、IL-1β和TNF-α的表达明显下调，细胞凋亡减少。此外，也观察到了睾丸和外周血中CD11b⁺Ly6C^high单核细胞和中性粒细胞数量明显降低。这些结果说明，移植的SLCs能够有效地抑制早期炎症级联反应。

图3. 移植的SLCs可减轻炎症反应

 

4. 在缺血再灌注后，SLCs通过纳米管将线粒体转移至常驻巨噬细胞

为进一步探讨SLCs调控免疫反应的机制，作者通过RNA-seq和GO分析发现，SLCs中表达上调的基因与纳米管形成和免疫反应密切相关。鉴于线粒体在巨噬细胞功能调控中的关键作用，以及纳米管能介导细胞间物质（包括细胞器）转运，作者将SLCs与巨噬细胞共培养以验证线粒体转移。共培养结果显示，SLCs与巨噬细胞间形成纳米管状连接，且用荧光染料标记的SLCs线粒体向巨噬细胞转移，转移效率和线粒体活性均较高。为排除染料泄漏的可能，采用mito-DsRed慢病毒感染以标记SLCs线粒体后再次共培养，结果证实SLCs中的线粒体主要是通过纳米管转移到巨噬细胞中。同样地，这一结果在体内也得到了验证。

图4. 纳米管介导线粒体从SLCs转移到巨噬细胞

 

5.  SLCs感知ROS并以TRPM7依赖性方式刺激线粒体转移

接着，为揭示SLCs向巨噬细胞转移线粒体的分子机制，作者关注识别线粒体损伤相关分子模式（DAMPs）的模式识别受体（PRR）在其中的作用。通过RNA-seq分析，发现TRPM7是SLCs中表达最高的PRR之一，作为感知损伤信号的首要候选受体，并确定其为纳米管介导线粒体转移所必需的蛋白复合物的关键组分。为验证TRPM7在细胞间线粒体通讯中的作用，利用shTRPM7慢病毒敲低SLCs中TRPM7表达，结果显示线粒体转移效率显著降低。已知TRPM7可被ROS激活，睾丸扭转会导致巨噬细胞线粒体损伤、释放ROS，促使线粒体转移。即使在H₂O₂诱导ROS的处理下，敲低TRPM7的SLCs线粒体转移依旧受限，表明ROS以部分依赖TRPM7的方式诱导线粒体转移。此外，在连接SLCs与巨噬细胞的纳米管中检测到肌球蛋白Ⅱ，它是TRPM7下游的骨架蛋白，能促进线粒体转移。通过移植敲低TRPM7的SLCs及AAV介导内源性SLCs中TRPM7敲低，均验证了上述细胞实验的结果。综上表明SLCs感知ROS并以TRPM7依赖性方式刺激线粒体转移。

图5. TRPM7是纳米管进行线粒体转移所必需的

 

6. SLCs部分通过TRPM7介导线粒体从移植细胞向巨噬细胞转移来发挥睾丸抗衰老作用

另外，线粒体功能障碍在衰老睾丸的炎症中起着重要作用。作者发现衰老睾丸中上调的基因在“调节白细胞激活”、“调节氧化应激”、“细胞衰老”和“激活免疫反应”相关功能中富集，下调的基因注释为“组装蛋白复合物”、“基于微管的运输”、“沿微管运输”和“细胞通讯调节”。提示TRPM7介导的线粒体转运可能也发生在衰老的睾丸中。同样地，将感染mito-DsRed慢病毒的SLCs或SLCs^shTRPM7移植到老年小鼠睾丸中，证实了其中SLCs能通过TRPM7依赖的方式将线粒体转移到巨噬细胞。进一步研究显示，抑制TRPM7表达会削弱老年小鼠的生殖功能，包括减少生殖细胞数量、降低精子质量和生育能力。这些发现表明TRPM7表达在抗睾丸衰老中发挥着重要作用。

图6. SLCs与SLCs^shTRPM7对老年小鼠睾丸功能的治疗作用

 

 

总结

综上所述，在急性和慢性炎症反应期间，SLCs主动与活化的巨噬细胞建立连接并将线粒体转移至其中，以减轻炎症和调节睾丸稳态。另外，TRPM7的表达可以促进巨噬细胞获得线粒体，这一过程会触发巨噬细胞从促炎表型向抗炎表型快速转变，保护局部微环境免受急性和慢性免疫炎症损伤。本研究为SLCs疗法恢复睾丸功能从而治疗生殖系统疾病提供了新的见解。

图7. SLCs将线粒体转移至睾丸组织常驻巨噬细胞的示意图