对于从事细胞或动物实验的基因调控研究的科研工作者来说，根据实验目的来选择适合的基因操作工具，不仅能节约时间和成本，更能让基因调控效率翻倍。

首先，需要考虑研究对象是细胞还是动物，如果是细胞实验，可选择慢病毒或者腺病毒；如果是动物实验，通常选择腺相关病毒（AAV）来实现精准的基因递送；

其次还需要考虑载体的表达时间与实验观察时间是否相符、其可容纳的基因片段大小与目的基因大小是否匹配等因素。

汉恒生物提供的质粒与工具病毒选择指南详见下表：

	质粒	慢病毒	腺相关病毒	腺病毒
是否整合	转染与整合效率很低	随机整合并稳定表达	不整合	不整合
表达丰度及速度	24h开始表达	高水平表达，细胞水平72h达到稳定，动物水平约需要96h，开始表达	表达慢，细胞水平需要3-4天左右，动物水平需要2周左右开始表达	高水平表达，细胞水平36h可达到高峰，动物水平约72h达到高峰
维持表达时间	3-7天	稳定表达	稳定表达3-6月	体内1-3周，体外一周
滴度	—	108TU/ml 109TU/ml	1012v.g/ml 1013v.g/ml	1011PFU/ml 1010PFU/ml
克隆容量	5-8kb的外源基因片段	不超过4kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低	不超过4kb的外源片段	高达5.5kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低
细胞实验	细胞系，部分细胞转染效率低	适合，广谱	AAV-DJ比较适合，其他血清型感染效率较差	适合，广谱，感染效率高，适合原代细胞感染
动物实验	不适合	感染效率低，根据观察时间和注射部位选择	非常适合，极低免疫原性	较适合，免疫原性较高，根据观察时间和注射部位选择
选择指南	做细胞实验外源基因片段较大，需要维持表达时间较短	做细胞实验需要稳定表达	做动物实验，需要维持表达时间较长的	外源基因片段较大，需要维持表达时间较长

 

选对调控工具，是实验成功的基础。但要提升基因调控效率，你可能还会遇到如下问题：

 

Q1: 什么是VP、PFU、IU?

答： 不同的概念源于不同的滴度测定方法，这些方法包括2类：物理方法（VP）和生物学方法（GTU、PFU、TCID50）。

VP：病毒颗粒（viral particle），是“活”（有感染性） 和 “死”（无感染性）的腺病毒颗粒的总量。

PFU：空斑形成单位（plaque formation unit），是有感染性的 “活”的腺病毒的总量，即腺病毒得活性单位。

IU：感染单位（infectious unit），和PFU一样，是另一种腺病毒活性单位。测定方法是TCID50法。

 

Q2:什么是MOI？

答：MOI，感染复数，是指病毒对细胞的感染能力，细胞需要的MOI值越高，证明细胞越难被感染。通常把某株细胞80%被感染时所需要的病毒颗粒数与细胞数目的比值作为该株细胞的MOI值。

 

相关计算公式：

每孔加病毒量（μL）=MOI × 细胞数 / 病毒滴度（TU/mL或PFU/mL）×1000

MOI=（病毒滴度 × 病毒体积）/ 细胞数

 

Q3：收到病毒后如何保存？

答：收到病毒液后若在短期内使用，可将病毒放置于4 ℃保存，并最好在一周内使用完；如需长期保存，可按需分装好放置于-80 ℃，以避免使用过程中反复冻融；如要置于液氮罐保存则需更换专门的保存管。另外，若病毒储存时间超过6个月，汉恒生物建议在使用前重新测定病毒滴度。

 

Q4：病毒使用过程中如何进行稀释？

答：需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用PBS或培养目的细胞用的无血清培养基（含血清或含双抗不影响病毒感染）混匀分装后置于 4 ℃保存（一周内使用完最佳）。以慢病毒为例：如原病毒标记的滴度为1x10⁸ TU/mL，取10 μL至90 μL到常规培养基中，即可得到1x10⁷ TU/mL滴度的病毒。

 

Q5：用于病毒感染的细胞接种量是多少？

答：根据细胞大小和增殖的速度调整细胞接种量，以保证在感染后2~3天细胞刚好快长满培养皿底部为宜。针对大部分细胞系：传代周期在2-3天，感染时细胞铺板的密度保持在30-50%左右，则细胞增殖48 h后细胞汇合度约在90%左右；针对某些原代细胞：由于细胞增长缓慢，可以在接种时提高汇合度到50-60%左右，但要确保在感染后2天细胞汇合度达到90-100%；针对非分裂细胞：如神经元细胞，接种后不再增殖，此时可以按照100%的汇合度进行接种。

 

Q6：如何确定向细胞中加入病毒的最佳时间？

答：慢病毒感染细胞后需要48-72 h观察到病毒携带的基因表达，腺病毒感染细胞后需要36-48 h观察到病毒携带的基因表达，应在细胞汇合度30-50%且细胞状态良好时加入病毒。