CAR-T ，全称Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。

 

近年来，研究人员对CAR-T的研究又更进了一步，他们通过一个由15个氨基酸组成linker将IL13突变蛋白和HER2单链抗体连接起来。与CD3 ζ、CD28胞内信号链形成一个『双价二代CAR分子』，称之为『串联CAR』或者『TanCAR』。
 

 

TanCAR-T同时识别HER2和IL13Rα2的效应『高于单个识别的累加效应，而且T细胞活性更持久，表现出优越的溶解自体恶性胶质瘤的能力，减缓肿瘤抗原逃逸现象。』

 

CAR T细胞治疗后GBM复发中存在抗原逃逸变体


A：检测原发性GBM切除样品和U373的单细胞悬液HER2和IL13Rα2抗原的表达，并通过流式细胞术分析。


 

B:   过继转移后，使用共免疫荧光对HER2和IL13Rα2靶向HER2和IL13Rα2的CAR T细胞治疗后复发的U373异种移植物的分析。

注：【过继转移】即通过输注免疫细胞或免疫分子，将一个接触过抗原的个体(供体)所具有的免疫反应性被动地转移给未被免疫的个体。


构建和计算机查询HER2 /IL13Rα2二价CAR分子的结构功能

表1：将个体FRP5-scFv和IL-13突变蛋白结构域的能量分别对应HER2和IL13Rα2，TanCAR与HER2和IL13Rα2，以及集体对接


 

TanCAR明显结合HER2和IL13Rα2，并介导增强的T细胞对自体GBM和GBM细胞系的反应性。

使用可溶性HER2和IL13Rα2来证实TanCAR外结构域与TAA的明显的非特异性以及双特异性结合



 

A：在离体培养物中表达稳定超过12周，检测UPN1,2和3在TanCAR T细胞处理后特异性地分泌IFN-γ和IL-2表达水平。


B：细胞溶解能力测定


C：为了评估它们的相对细胞因子分泌能力，以1T细胞与4个肿瘤细胞的比例与TanCAR，biCAR，HER2，IL13rα2和CARpool T细胞共培养U373神经胶质瘤细胞。在24小时收集上清液，并使用ELISA分析IL-2和IFN-γ。


TanCAR T细胞以剂量依赖性方式与HER2或IL13Rα2接触被激活，并在同时遇到HER2和IL13Rα2时显示出超加性激活。



 

我们在涂有HER2.Fc，IL13Rα2.Fc（一种无关靶标）（GD2.scFv抗独特型）和非特异性T细胞受体兴奋剂的增加密度的平板上（OKT3）培养TanCAR T细胞。24小时分析上清液中IFN-γ和IL-2。

 

结果：当TanCAR T细胞在任何抗原密度下同时遇到任何一种TAA时，细胞因子产生显着增加（P <0.001），并且高于单次抗原接触时最大细胞因子浓度之和，表示遇到的超加性效应两种抗原分子。
 

TanCAR T细胞表现出增强的和持续的离体抗肿瘤活性


 

比较TanCAR，biCAR，CARpool和非特异性CAR T的抗肿瘤细胞活性的持续时间。基于电阻抗的肿瘤细胞培养系统（xCELLigence）。以1T细胞接种10个的U373细胞的比例，基于阻抗的细胞指数公式来量化肿瘤细胞的密度（图A）。在150小时的时间推移中评估U373神经胶质瘤细胞的实时杀伤。

B：以1T细胞与10个肿瘤细胞的比例接种1周后，评估CD4和CD8耗竭标志物PD-1，LAG3和TIM3的表达。

TanCARs在增强的二价免疫突触中异二聚化HER2和IL13Rα2。




 

研究TanCAR细胞是否是二价的，确定了它们的靶抗原在CAR T细胞-GBM接触点的定位。

将TanCAR，IL13Rα2CAR，HER2 CAR和NT T细胞与U373-GBM细胞一起温育，然后对HER2和IL13Rα2染色，可视化IS（免疫突触）（图B）


C：IS积累的定量揭示了，与非特异性T细胞相比，TanCAR IS中HER2和IL13Rα2的集体聚集增加。


 

A：使用受激发射损耗（STED）超分辨率显微镜，利用连续波显微镜，我们成像TanCAR T细胞/ U373 ISs。

B：能够在TanCAR / U373 IS上以比biCAR / U373 IS更高的频率观察HER2和IL13Rα2配体异二聚体。


A 、B：HER2和IL13Rα2像素强度的线剖面显示足够高的分辨率，表明聚集体足以支持HER2和IL13Rα2与TanCAR外结构域的共同对接。


C：探测IS处的HER2-IL13Rα2异二聚体。在小于40nm的接近度内检测蛋白质 - 蛋白质相互作用。

A：测量了IS处的F-肌动蛋白积累和微管组织中心的极化（MTOC），2种处理细胞的溶解参数，以评估TanCAR二价是否与功能优势相关。



 

B：与biCAR T细胞相比，TanCAR T细胞显示出明显增加的ISOC MTOC极化，表明MTOC与IS的距离减少，以及IS处的F-肌动蛋白积累显着增加，从而表明具有优异的细胞溶解潜力。

 

总的来说，结果表明TanCART细胞在IS处共同募集并共同结合HER2和IL13Rα2，并且TanCAR介导的ISs具有显着更好的溶解潜力。通过双TAA IS的更高密度聚类，证明了将靶TAA募集到T细胞-GBM界面的能力，导致更强的T细胞活化。
 

TanCAR T细胞改善原位GBM的消除并减轻抗原逃逸。


 

A：GBM异种移植物用T细胞注射时，的每30个肿瘤细胞用约1T细胞处理。定量生物发光成像在预定时间点完成监测肿瘤生长。


 

B：肿瘤通过立体定位建立注射2.5×105表达eGFP-Firefly荧光素酶的U373细胞到SCID小鼠右侧额叶皮层。在肿瘤细胞注射后第8天，肿瘤内注射1×106处理小鼠TanCAR T细胞（n = 10），HER2 CAR T细胞（n = 10），IL13Rα2CAT T细胞（n = 10）或NT T细胞（n = 5）。预计的T细胞/ GBM细胞比率为1:30。未经治疗的老鼠（n = 5）用作对照。

 

 

B：无疾病进展生存期(Progression-free survival, PFS)：PFS更侧重反映肿瘤治疗的中短期疗效。

C: 中位总生存期 (overall survival, OS)：OS更侧重反映肿瘤治疗的整体结果。

D：对HER2和IL13Rα2是昏暗染色。



E：TanCAR T细胞转移后的肿瘤复发通过生物发光成像显着减小



 

为了评估TanCAR T细胞与这些双特异性抗体的抗肿瘤功效，进行了第二次原位体内实验，其中在T细胞注射时每3个肿瘤细胞用约1T细胞处理已建立的原位GBM异种移植物。中位OS是主要结果。

结果：Pool：5只中0只存活（0%）

          biCAR：10只中3只存活（30%）

          TanCAR：13只全部存活（100%）


 

☞ 总 结 ✍

 

✔ TanCAR T细胞可清除胶质母细胞瘤模式小鼠体内的大多数癌细胞

✔ 阻止肿瘤抗原逃逸

✔ 基于靶向特异性表面分子，可以更好地控制肿瘤和改善小鼠存活的周期