全球结直肠癌（CRC）的发病率每年都在增加，而奥沙利铂是肿瘤组织手术切除后常用的化疗药物之一，尤其适用于II期和III期患者。不幸的是，在CRC治疗中获得性奥沙利铂耐药性仍然是一项重大挑战。因此，阐明潜在的作用机制和制定抗奥沙利铂耐药性相关有效策略是临床上的首要任务。

 

山东大学第二医院临床实验室王传新团队在临床结肠癌治疗方面取得重大成果，并在国际著名学术期刊Molecular Cancer 【IF：7.776】上在线发表相关结论。作者研究了miR-128-3p作为CRC预后分子标记及其在接受奥沙利铂的CRC患者体内的潜在转录调控作用。此外，还探索了一种基于外泌体递送miR-128-3p介导的靶向奥沙利铂耐药性的CRC化疗敏感治疗策略。

 

值得一提的是，实验中使用的慢病毒（LV）等产品正是来自汉恒生物。

 

1. 奥沙利铂耐药性获得诱导上皮间质转化（EMT）作用并增强CRC中药物外排

 

首先，作者通过奥沙利铂药物处理大肠癌细胞系，并不断增加药物处理浓度，随后将细胞移植到裸鼠中，循环培养三代后获得奥沙利铂耐药性细胞系HCT116OxR和HT29OxR。与亲代细胞系相比，HCT116OxR和HT29OxR细胞系对奥沙利铂药物不敏感，主要表现为IC50增加和药物诱导的细胞凋亡率下降。同时，耐药细胞的表型也发生了变化，例如：细胞间粘附降低，细胞极性丧失变为梭状，伪足形成增加。此外，耐药细胞的迁移和侵袭能力也明显增强。细胞中化疗诱导的EMT现象的典型变化包括耐药细胞中E-钙粘蛋白表达降低，N-钙粘蛋白、波形蛋白和纤维连接蛋白表达增强。奥沙利铂处理24小时后的铂定量分析表明耐药细胞中胞内铂总量和结合于DNA的铂都明显低于亲代细胞。使用γ-H2AX表达的核灶作为DNA双链断裂的指示物的免疫荧光测定显示，与奥沙利铂耐药细胞相比，奥沙利铂在亲代细胞中诱导更多的DNA损伤。

 

 

图1. 奥沙利铂耐药细胞系HCT116OxR和HT29OxR中存在上皮间质转化（EMT）现象并且药物外排作用增强

 

2. miR-128-3p低水平表达是大肠癌获得奥沙利铂耐药性的必要条件

 

作者通过RT-PCR检测发现，与正常肠上皮细胞系FHC相比，miR-128-3p在七种结肠癌细胞系中表达显著降低，并且在HCT116和HT29细胞系中miR-128-3p表达明显高于其他CRC细胞系，此外，在耐药性细胞中miR-128-3p表达显著低于亲本细胞。为了进一步探索miR-128-3p在奥沙利铂抵抗中的作用，作者利用慢病毒表达系统在耐药性CRC细胞中过表达miR-128-3p。与转染了lenti-NC的细胞株相比，过表达miR-128-3p的耐药细胞中，奥沙利铂处理时IC50减低，细胞凋亡增加，E-钙粘蛋白表达升高，N-钙粘蛋白、波形蛋白和纤维连接蛋白表达降低，细胞迁移和侵袭能力下降，以及降低了耐药细胞中奥沙利铂的外排作用。奥沙利铂处理24小时后的铂定量检测发现过表达miR-128-3p的耐药细胞中铂总量及与DNA结合的铂含量显著升高，此结果表明降低细胞中铂含量在奥沙利铂抵抗中起重要作用。过表达miR-128-3p的耐药细胞中核灶γ-H2AX的表达明显增加。那么，在体内miR-128-3p是否会使CRC细胞对化疗试剂敏感作用呢？于是作者将过表达miR-128-3p的HCT116OxR细胞皮下种植在裸鼠中，然后奥沙利铂处理，结果表明miR-128-3p过表达显著降低HCT116OxR移植小鼠的奥沙利铂耐药性。总之，体内和体外实验都证明miR-128-3p可以改善CRC中奥沙利铂耐药性，因此miR-128-3p低水平表达是CRC抵抗奥沙利铂必不可少的因素。

 

 

图2. 大肠癌细胞系中miR-128-3p的表达及其对奥沙利铂的耐药作用

 

3. 肿瘤组织中miR-128-3p表达水平与大肠癌患者中奥沙利铂耐药性显著相关

 

接下来，作者从临床方向对miR-128-3p在CRC中的作用进行分析。作者使用qRT-PCR分析了各样品组中的miR-128-3p表达水平，发现在奥沙利铂治疗且患有肿瘤复发的患者组织中miR-128-3p表达水平显著降低。并且在奥沙利铂治疗时，与非进展期患者（非PD）相比，进展期患者（PD）中miR-128-3p表达水平也显著降低。ROC曲线分析显示miR-128-3p可以明显的区分PD患者和非PD患者，Kaplan-Meier生存曲线分析也表明miR-128-3p高表达的患者拥有更长的无进展生存期（PFS）。Cox回归单变量和多变量分析显示奥沙利铂治疗与miR-128-3p高表达的CRC患者PFS改善显著相关。因此，miR-128-3p可作为CRC患者响应奥沙利铂的独立预测因子。

 

 

图3. miR-128-3p的表达水平与CRC患者中奥沙利铂治疗反应相关

 

4. 转染miR-128-3p的FHC细胞中miR-128-3p可以高水平表达，并通过外泌体分泌转移至目的细胞中

 

作者将lenti-miR-128-3p或lenti-NC转染FHC细胞中并检测外泌体，与转染lenti-NC的FHC细胞及其外泌体相比，在转染了lenti-miR-128-3p的FHC细胞及其外泌体中miR128-3p表达水平均显著升高。培养基中miR-128-3p的表达在RNase A处理后没有变化，但是当同时用RNase A和Triton X-100处理时显著降低，表明释放的miR-128-3p不是直接被释放，而是受到双层膜保护的。128-exo（用膜磷脂染料PKH67标记）与HCT116OxR细胞共同孵育，激光扫描共聚焦显微镜检测发现受体细胞表现出很高摄取率。孵育24小时后，> 80％的受体细胞对PKH67荧光呈阳性，表明128-exo被HCT116OxR细胞高效吸收。128-exo孵育后增强了miR-128-3p的表达接近350倍，而NC-exo对miR-128-3p表达水平没有影响，并且延长共孵育时间会引起HCT116OxR细胞中miR-128-3p水平相应增加。总之，这些数据表明FHC-128细胞有效分泌含有miR-128-3p的外泌体，并直接转移至HCT116OxR细胞。

 

图4. lenti-miR-128-3p转染FHC细胞后鉴定外泌体miR-128-3p的表征及作用

 

5. 外泌体介导的miR-128-3p转移通过影响靶基因表达逆转奥沙利铂抵抗作用

 

接下来，作者研究了外泌体转移的miR-128-3p是否能够改善耐药细胞对奥沙利铂的敏感性。细胞活性剂凋亡检测发现128-exo外泌体与耐药细胞共孵育后可以提高细胞对奥沙利铂的敏感性，这一作用被miR-128-3p抑制剂阻断。为了检测是否还有除miR-128-3p以外的其他因子影响这一过程，作者将miR-128-3p mimic电转进外泌体，同时不影响外泌体的物理性质。实际上，HCT116OxR细胞与成功转染miR-128-3p mimic的外泌体共孵育可以增加细胞对奥沙利铂的敏感性。重要的是，与128-exo孵育抑制EMT，主要表现为细胞中上皮标志物表达上调和间充质标志物表达下调，而anti-128可以阻断这一作用。此外，128-exo抑制了耐药性CRC细胞的迁移和侵袭，划痕实验再次验证了这一结论，并且anti-128可以消除这一作用。与128-exo共孵育可以使胞内Pt总量及结合与DNA的Pt均显著增加。在奥沙利铂治疗24小时后，对照组中核灶γ-H2AX表达水平仍然很低，但是在128-exo共培养组中显著增加。在去除128-exo后，受体细胞中恢复的奥沙利铂敏感性维持至少10天。体内实验中，瘤内注射miR-128-3p外泌体，耐药细胞中恢复了对奥沙利铂的响应，并伴随着肿瘤内miR-128-3p表达水平的增加。此外，携带miR-128-3p mimic外泌体也是有效的。因此，这些体外和体内实验结果都证明通过128-exo外泌体介导的miR-128-3p过表达逆转了CRC细胞中的奥沙利铂抵抗作用。

 

图5. 通过128-Exo介导miR-128-3p的细胞间转移并使CRC细胞对奥沙利铂敏感

 

 

6. Bmi1和MRP5参与miR-128-3p介导的奥沙利铂抵抗过程

 

作者进一步探索了miR-128-3p介导奥沙利铂抵抗的中介分子。使用TargetScan和Miranda进行生物信息学分析发现Bmi1和MRP5的3'-UTR含有miR-128-3p的预测结合位点。在CRC组织中miR-128-3p表达水平与Bmi1或MRP5表达之间呈负相关。接下来作者采用双荧光素酶检测验证了Bmi1和MRP5是miR-128-3p的直接靶点。与对照组相比，过表达miR-128-3p的细胞中Bmi1和MRP5的mRNA和蛋白表达水平均降低。随后作者在lenti--miR-128-3p细胞中转染了分别携带Bmi-wt/Bmi1-mut或MRP5-wt/MRP5-mut 3’UTR的pcDNA3.1载体，细胞活力及凋亡实验表明只有转染了Bmi1-mut或MRP5-mut的细胞表现为抵抗，而转染了Bmi1-wt和MRP5-wt的细胞无此现象，并且该基因被miR-128-3p沉默了。WB实验表明用Bmi1-mut转染的细胞可以表达Bmi1，N-钙粘蛋白，波形蛋白和纤维连接蛋白，并抑制E-cadherin蛋白表达，而用Bmi1-wt转染的细胞中则被miR-128-3p沉默并且不能恢复EMT。此外，过表达miR-128-3p存在情况下，Bmi1-mut的表达增强了HCT116OxR的细胞侵袭和迁移。总之，这些数据表明miR-128-3p通过靶向Bmi1进而调节化疗诱导的CRC细胞的EMT。作者进一步探索miR-128-3p介导奥沙利铂抵抗的药物外排作用机制。WB实验表明在lenti-miR-128-3p转染的HCT116OxR细胞中，MRP5-mut转染后MRP5蛋白表达显著增加，而空白组、对照组或用MRP5-wt转染后MRP5蛋白都保持不变。在lenti-miR-128-3p转染的HCT116OxR细胞中，与空白组、对照组和MRP5-wt转染组相比，转染MRP5-mut组中胞内Pt总量和结合与DNA的Pt含量均显著降低。在lenti-miR-128-3p转染的HCT116OxR细胞中核灶γ-H2AX表达检测表明显示，与其他组相比，奥沙利铂处理24小时后MRP5-mut组中诱导的DNA损伤较少。此外，128-exo处理显著降低耐药细胞中Bmi1和MRP5蛋白质表达水平，在受体细胞中miR-128-3p抑制剂可以阻断这种作用。通过瘤内注射表达miR-128-3p的外泌体可阻断Bmi1和MRP5相关的信号传导进而恢复耐药细胞的奥沙利铂响应。这些研究结果表明，128-exo通过负调节Bmi1和MRP5表达促进CRC细胞中奥沙利铂的敏感性，这两个基因分别参与了奥沙利铂诱导的EMT和药物外排作用。

 

图6. 携带miR-128-3p的外泌体通过靶向Bmi1和MRP5使CRC细胞对奥沙利铂敏感

 

 

图7. CRC治疗中基于外泌体miR-128-3p的信号传导途径示意图。 在奥沙利铂耐药CRC细胞中，来源于FHC-128细胞的外泌体miR-128-3p通过竞争性结合Bmi1和MRP5逆转奥沙利铂抵抗，诱导E-钙粘蛋白表达水平升高（抑制EMT表型）并减少奥沙利铂外排。

 

 

THE END

结论：本文研究揭示miR-128-3p不仅是临床上奥沙利铂响应的分子标记物，还是潜在的临床治疗靶点。通过外泌体递送miR-128-3p可以增加CRC细胞对奥沙利铂的敏感性，此外还提供了一种新的CRC治疗策略。