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慢病毒避雷指南
人阅读 发布时间：2019-08-06 09:09
病毒一直是基因转导研究中的一大利器，尤其 慢病毒 更是实验室的常客。然而，慢病毒的存储不当或用量不合适，可能会导致转染效率低，细胞状态差等情况。为了让慢病毒更好地为我们的实验服务，先来看看慢病毒使用过程中我们要注意哪些问题吧。
首先是慢病毒的安全和存储
慢病毒相关实验需要在生物安全柜（BL-2 级别）内进行操作，如果不小心溅出也不要惊慌，立即用 70% 乙醇加 1% 的 SDS 溶液擦拭干净即可。接触过病毒的枪头，离心管，培养板等要用 84 消毒液浸泡后统一处理。病毒相关的废弃物也需要特殊收集再统一经高温灭菌处理哦。
慢病毒是存储在 -80 ℃ 的，如果您在收到慢病毒的一周内就会使用，也可放在 4 °C 保存，避免反复冻融，有必要可以先进行分装。
接下来就是慢病毒的使用了，首先需要摸索病毒感染的 MOI
MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒数，通常 MOI 越高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。
用 96 孔板摸索梯度值：
实验前一天，以每毫升 3~5X10^6 个目的细胞接种 96 孔培养板中的 12 个孔，
体积为 90 µl。感染预实验共分为四组，每组三个不同梯度的 MOI。
实验开始，配备 1X10^8 TU/ml、1X10^7 TU/ml、1X10^6 TU/ml 病毒液。
将 10 µl 三个不同梯度的病毒加到各组的相应孔中。加入的病毒量分别为 1X10^6TU，1X10^5 TU，1X10^4 TU，而细胞经过生长，此时细胞的数目大约为 1 X10^4 个，所以三个孔的 MOI 分别为 100、10、1
感染 3～4 天后，观察荧光表达情况，通过细胞感染效果，确认目的细胞的感染条件和感染参数。
※ 每孔加病毒量（µl）=MOI*细胞数/滴度（TU/ml）×1000
确定了细胞的 MOI 值，下面就要开始进行细胞的感染
我们推荐 1/2 小体积感染法，即在正常培养液的一半量的情况下加入慢病毒，感染 4h 后补足培养液至正常体积，感染 24h 后换液。对于适用 Polybrene 的细胞，也可适量加入来提升感染效率，它最常用的工作浓度为 6～8 µg/ml。
感染后 48h，对于带 GFP 报告基因的病毒，可通过荧光显微镜观测 GFP 表达效率，如果要筛选稳定携带 Puromycin 抗性基因的病毒，则需换上含适当浓度 Puromycin 的新鲜完全培养液。
附：部分细胞慢病毒感染参数
注：不同实验室由于细胞的来源、代数和细胞状态等因素的影响，MOI 值也略有差异，以下数据是在细胞感染效率在 85～100% 细胞状态良好的情况下获得的，仅供参考。
慢病毒相关实验需要在生物安全柜（BL-2 级别）内进行操作，如果不小心溅出也不要惊慌，立即用 70% 乙醇加 1% 的 SDS 溶液擦拭干净即可。接触过病毒的枪头，离心管，培养板等要用 84 消毒液浸泡后统一处理。病毒相关的废弃物也需要特殊收集再统一经高温灭菌处理哦。
慢病毒是存储在 -80 ℃ 的，如果您在收到慢病毒的一周内就会使用，也可放在 4 °C 保存，避免反复冻融，有必要可以先进行分装。
接下来就是慢病毒的使用了，首先需要摸索病毒感染的 MOI
MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒数，通常 MOI 越高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。
用 96 孔板摸索梯度值：
实验前一天，以每毫升 3~5X10^6 个目的细胞接种 96 孔培养板中的 12 个孔，
体积为 90 µl。感染预实验共分为四组，每组三个不同梯度的 MOI。
实验开始，配备 1X10^8 TU/ml、1X10^7 TU/ml、1X10^6 TU/ml 病毒液。
将 10 µl 三个不同梯度的病毒加到各组的相应孔中。加入的病毒量分别为 1X10^6TU，1X10^5 TU，1X10^4 TU，而细胞经过生长，此时细胞的数目大约为 1 X10^4 个，所以三个孔的 MOI 分别为 100、10、1
感染 3～4 天后，观察荧光表达情况，通过细胞感染效果，确认目的细胞的感染条件和感染参数。
※ 每孔加病毒量（µl）=MOI*细胞数/滴度（TU/ml）×1000
确定了细胞的 MOI 值，下面就要开始进行细胞的感染
我们推荐 1/2 小体积感染法，即在正常培养液的一半量的情况下加入慢病毒，感染 4h 后补足培养液至正常体积，感染 24h 后换液。对于适用 Polybrene 的细胞，也可适量加入来提升感染效率，它最常用的工作浓度为 6～8 µg/ml。
感染后 48h，对于带 GFP 报告基因的病毒，可通过荧光显微镜观测 GFP 表达效率，如果要筛选稳定携带 Puromycin 抗性基因的病毒，则需换上含适当浓度 Puromycin 的新鲜完全培养液。
附：部分细胞慢病毒感染参数
注：不同实验室由于细胞的来源、代数和细胞状态等因素的影响，MOI 值也略有差异，以下数据是在细胞感染效率在 85～100% 细胞状态良好的情况下获得的，仅供参考。
对于一些特殊的细胞在感染时我们还要注意以下事项
◆ 悬浮细胞：感染悬浮或半悬浮细胞，要通过平角离心转染法，低速（200´g）离心 1 h，然后放入培养箱中正常培养即可。若由于实验条件有限，没有平角离心机，可用离心管代替。
◆ 极难感染的细胞：对于极难感染的细胞，如 DC（树突状细胞）等，可采用多次感染的方法，即感染 24 h 后，更换新鲜病毒进行二次感染，可显著提升感染效率。
◆ 传代能力较差的原代细胞：对于一些传代能力较差的原代细胞，比如 BMSC 等，建议采用滴度更高的腺病毒进行感染。
A&Q| 以下是我们整理的在细胞感染中可能遇到的其他问题
1. 对照病毒或目的病毒感染细胞以后，细胞形态发生改变或者细胞死亡，是否说明病毒有毒性？
首先，确定病毒是否有支原体或细菌污染；
其次，确定病毒感染 MOI 是否过高，梯度稀释后感染，寻找合适的 MOI。
同时考虑目的细胞可能比较敏感，更换其它细胞感染确定病毒是否有问题。病毒对某些敏感细胞有毒性可能是不可避免的。
如果以上都排除后细胞状态仍然不好，尝试增加血清含量，观察细胞状态是否好转。
2. 病毒感染目的细胞效率低？
和以下几个因素有关：
◆ 病毒活性：解冻病毒一定要在冰上进行，尽量避免反复冻融， -80℃ 保存半年以上需要重新测滴度；
◆ 目的细胞：最好预实验测试过，看病毒载体是否合适感染目的细胞。一些难感染的细胞，如贴壁不好的细胞，原代细胞等，或者体内动物实验适合用腺病毒或 AAV；
◆ 当然也和 MOI 值、感染时间以及是否加入 polybrene 等因素有关，可在实验中进行适当的摸索和调整，提升慢病毒的感染效率
3. 为什么过表达慢病毒比对照的荧光要暗？
每种病毒有自己的载体容量，基因的插入，会影响位于其下游的荧光蛋白等基因的表达。对照病毒或干扰病毒，由于没有插基因或者插入基因非常短，荧光会强。而插入了较长基因之后，荧光的亮度会随着插入基因的长度以及特殊结构的存在等而减弱。
看了这么多，大家是不是能够对慢病毒的使用得心应手了呢？
有没有迫不及待想要买来做实验的冲动？
来看看，除了你还有谁在用汉恒的慢病毒吧
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