2023年10月11日首都医科大学基础医学院王辰院士联合中日友好医院和浙江大学医学院附属第二医院团队在Signal Transduction and Targeted Therapy（IF：38.104）上发表题为“Eosinophils promote pulmonary matrix destruction and emphysema via Cathepsin L”的研究论文。该研究揭示了在吸烟模型中，主要诱导中性粒细胞为主的炎症反应，在弹性蛋白酶多次给药诱导的慢性肺气肿模型中，则出现以嗜酸性粒细胞为主的炎症反应。进一步研究表明，嗜酸性粒细胞通过产生溶酶体组织蛋白酶L（CTSL）降解破坏细胞外基质（ECM），抑制肺组织的损伤修复，从而促进了肺气肿的发生发展过程，在慢阻肺患者血清中，CTSL的表达水平与嗜酸性粒细胞增高相关。值得注意的是，本研究使用了汉恒生物提供的CTSL干扰腺相关病毒。

猪胰腺弹性蛋白酶(PPE)可以诱导肺气肿，所以作者首先通过气管内滴注PPE构建小鼠肺气肿模型，结果表明，与对照相比，平均线性截距显著增加，肺泡壁中的弹性纤维减少，在PPE的反复刺激下，炎症从一次PPE刺激引起的嗜中性转变为嗜酸性。随后对肺气肿、急性损伤和对照这三组肺细胞进行转录组分析，GO分析发现与对照组相比，急性损伤组免疫相关途径的基因存在显著上调，参与钙信号转导、血管平滑肌收缩和细胞粘附途径的基因基本上表现为下调表达。而肺气肿模型中与Ⅱ型炎症相关的炎性细胞因子的水平显著升高，与溶酶体功能相关的基因存在富集，说明PPE诱导的肺气肿模型中，急性嗜中性粒细胞炎症向慢性嗜酸性粒细胞炎症转变。

图1 嗜酸性粒细胞在弹性蛋白酶诱导的肺气肿中积累

构建卵清蛋白诱导的哮喘（传统嗜酸性粒细胞相关疾病）模型，对肺免疫细胞和基质细胞的转录组进行分析，将含有11405个基因的19775个优质细胞分成19个簇，基于经典标记对细胞类型进行注释，发现簇9、10和15高度表达经典的嗜酸性粒细胞标记。结合单细胞测序（scRNA-seq）中细胞类型特异性表达的信息进行反卷积分析，scRNA-seq定义的嗜酸性粒细胞群体9、10和15簇的表达模式与经典定义的嗜酸性粒细胞之间存在很强的相关性，簇9、10和15分别分布在ECP+细胞的一个子集中，被认为是嗜酸性粒细胞，GO富集分析表明，嗜酸性粒细胞与溶酶体、脱颗粒、炎症反应、吞噬体和ECM降解相关，说明嗜酸性粒细胞对肺气肿的发展至关重要。

图2 肺细胞亚群的特征

嗜酸性粒细胞在哮喘和PPE诱导的肺气肿模型中积累，对这些嗜酸性粒细胞重新聚类鉴定出7个亚型，利用Monocle沿着可能的粒细胞生成轨迹进行拟时基因趋势分析，区分嗜酸性粒细胞群体，以确定嗜酸性粒细胞之间的基因动态转化关系，从对照模型中的C7和C4细胞开始，到肺气肿模型中的C2和C5细胞结束表明嗜酸性粒细胞的分化和成熟发生在一个紧密组织的过程中，早期拟时样本集中在哮喘组中，后期拟时样品在肺气肿模型中富集，并且富含FcγR介导的吞噬和凋亡信号。利用这个结果进一步将嗜酸性粒细胞分为三种状态，状态1定义为哮喘相关嗜酸性粒细胞，状态3是肺气肿相关嗜酸性粒细胞，簇9、10和15富集于不同状态的细胞类群，推测疾病微环境在嗜酸性粒细胞分化和成熟中可能起重要作用。

图3 嗜酸性粒细胞的不同状态

利用SCENIC分析对ScRNA-Seq数据中转录因子（TFs）进行研究，基于连接特异性指数评估调节子活性得分，筛选调控强度显著、处于核心作用的TFs，在4组的4个模块中，PPE诱导的肺气肿模型模块3中转录因子Xbp1、Pparg、Bhlhe41和Usf2表达上调，并且具有最高的调控活性，PPE诱导肺气肿模型的模块4中，TFs包括Mafb、Tead1、Irf8和Runx3表达下调且调控活性最低。这说明嗜酸性粒细胞成熟和溶酶体产生有关，在成熟过程中还形成主要组织相容性复合物II类蛋白复合物组装体，并出现抗原呈递的能力降低的现象。电镜分析通过FACS获得的嗜酸性粒细胞，发现在肺气肿模型中，嗜酸性粒细胞表现出细胞质膜部分破坏，颗粒核心染色逆转，细胞质囊泡形成增多，说明特异性TFs可以调控嗜酸性粒细胞的成熟和分化。

图 4 与嗜酸性粒细胞成熟和分化相关的转录因子

之前的研究表明，针对嗜酸性炎症的疗法如利用抗体阻断IL-5，对COPD患者具有有益作用。肺组织的定性组织学分析也表明，阻断IL-5后，平均线性截距显著降低，肺泡壁的弹性纤维升高，肺嗜酸性粒细胞数量减少。利用转基因嗜酸性粒细胞缺陷小鼠模型(PHIL)特异性地减少嗜酸性粒细胞，与野生型对照相比，PHIL小鼠肺气肿显著减少，这些数据说明了嗜酸性粒细胞在肺气肿发展中起着至关重要的作用。

图5 嗜酸性粒细胞缺失可降低肺实质中的肺气肿水平

蛋白酶在细胞外基质的降解和重塑中是必不可少的。作者检测到蛋白酶CTSL动力学的转变类似于肺气肿发展过程中嗜酸性粒细胞的转变，并且在PPE诱导下，与PHIL小鼠相比，CTSL在野生型小鼠肺气肿的嗜酸性粒细胞中表达升高。而给予CTSL抑制剂的小鼠嗜酸性粒细胞数量明显下降，肺气肿严重程度显著降低。使用CTSL干扰腺相关病毒下调CTSL水平，可以得到与CTSL抑制剂一致的结果，肺气肿严重程度和嗜酸性粒细胞的百分比都表现出显著降低。从肺气肿模型中分离获得的嗜酸性粒细胞在弹性蛋白底物的测试中表明弹性蛋白分子具有弹性分解能力，这种能力受到CTSL抑制剂的限制，肺气肿模型中嗜酸性粒细胞释放的蛋白酶也表现出强大的胶原酶活性。这些数据说明肺气肿发展过程中肺部CTSL主要来源于嗜酸性粒细胞，且在PPE诱导的肺气肿中起促进ECM破坏的作用。

图6 来自嗜酸性粒细胞的CTSL对肺气肿至关重要

56例COPD患者的临床资料显示，COPD患者的CTSL定位于嗜酸性粒细胞，肺泡组织中的CTSL显著升高，血清CTSL和CTSS水平也有所升高，且COPD患者的嗜酸性粒细胞水平与血清CTSL水平呈正相关。胸部计算机断层扫描数据测定肺气肿指数与血嗜酸性粒细胞水平呈正相关(r = 0.627, P < 0.0001)。这表明COPD患者CTSL水平升高可能影响肺气肿的发展。

图7 嗜酸性粒细胞中CTSL的表达与COPD患者的肺气肿有关

该研究探讨了嗜酸性粒细胞在肺气肿病理生理中的作用机制，可能是通过嗜酸性粒细胞衍生的CTSL降解和重塑ECM导致肺气肿的发展。迄今为止，还没有批准针对COPD患者肺气肿的靶向治疗，这项研究强调了CTSL作为肺气肿患者治疗靶点的潜力。