作者在此前的研究中发现骨髓间充质干细胞（BMSCs）具有防止肝硬化发生的功能，并且lncRNA在其中起到了重要作用，但具体机制并不清楚。于是作者利用肝硬化模型对此问题进行了研究。首先作者通过CCl4诱导肝硬化并尾静脉注射BMSCs，进行切片染色发现肝硬化有明显好转。同时，通过蛋白印迹，作者也观察到肝硬化的一些标志蛋白α-SMA和Col1出现了明显下降。这说明BMSCs处理确实能有效减轻肝硬化。

 

图 1. 骨髓间充质干细胞（BMSCs）减轻肝硬化，并在体外阻止肝星状细胞（HSCs）激活

为了进一步探究肝硬化的机制，作者分析了肝硬化相关的RNA-seq数据，并发现lncRNA Kcnq1ot1在肝硬化的样品中表达上调。同时，人和鼠的肝星状细胞激活后，Kcnq1ot1也发生上调。更重要的是，BMSCs的处理可使Kcnq1ot1表达水平出现一定的下降。这说明，BMSCs可能通过抑制Kcnq1ot1来改善肝硬化。为了进一步验证这一结论，作者在BMSCs处理的样品中过表达Kcnq1ot1，发现肝硬化的一些标志蛋白再次上调，说明BMSCs确实是通过调控Kcnq1ot1表达来影响肝硬化过程。

图 2. Kcnq1ot1的表达在体内外肝硬化过程中均提高，并可被骨髓间充质干细胞所抑制

既然BMSCs主要是通过降低Kcnq1ot1的水平来减轻肝硬化，作者便考虑是否能直接敲低Kcnq1ot1来缓解肝硬化。作者用siRNA来敲低JS1细胞中的Kcnq1ot1，结果发现Kcnq1ot1的敲低能有效抑制JS1细胞的激活，并降低相关肝硬化标志蛋白的水平。同时，Kcnq1ot1的敲低还抑制了JS1细胞的增殖。这进一步证明了Kcnq1ot1表达水平在肝硬化中的重要功能。

 

图 3. 沉默lncRNA Kcnq1ot1抑制JS1细胞的增殖和激活

那么BMSCs是如何调控Kcnq1ot1表达水平的呢？作者利用starBase 3.0预测了与Kcnq1ot1结合的潜在小RNA并发现了miR-374-3p。通过荧光素酶实验，作者发现miR-374-3p能直接结合Kcnq1ot1。并且，在激活的JS1细胞中，miR-374-3p的表达下降，敲低Kcnq1ot1能提高miR-374-3p表达。而抑制miR-374-3p能提高肝硬化标记物，并导致JS1细胞加快增殖；过表达miR-374-3p则能降低肝硬化标记物表达，并抑制JS1细胞增殖。这些结果说明了miR-374-3p参与了肝硬化的调控。

结合starbase3.0网站预测，作者同时还发现，Fstl1也是miR-374-3p的直接靶标，那么Fstl1在肝硬化中是否也有作用呢？作者通过荧光素酶证实了Fstl1与miR-374-3p存在直接相互作用，并且敲低Fstl1也能降低肝硬化相关标记。这说明Fstl1在肝硬化中也有着重要的作用。

图 4. miR-374-3p 直接与lncRNA Kcnq1ot1 和 Fstl1结合

为了进一步分析Kcnq1ot1 与miR-374-3p 和Fstl1的关系，作者对Kcnq1ot1 和 miR-374-3p进行了敲低。Kcnq1ot1的敲低导致了肝硬化标志物和Fstl1的下降，而抑制miR-374-3p能反转这一下降趋势。过表达Fstl1能抑制si-Kcnq1ot1的效果。并且miR-374-3p的表达量与Kcnq1ot1 和 Fstl1的表达量均呈负相关。因此，Kcnq1ot1 通过影响miR-374-3p/Fstl1来抑制肝硬化过程。

图 5. LncRNA Kcnq1ot1通过miR-374-3p/Fstl1通路调控JS1细胞的激活

作者接下来通过JASPAR预测，并通过实验证实Creb3l1通过结合Kcnq1ot1的启动子来激活Kcnq1ot1的转录。而BMSCs的处理会降低Creb3l1的表达。过表达Creb3l1能增加Kcnq1ot1的表达，而敲低Creb3l1则增加miR-374-3p并抑制Kcnq1ot1和Fstl1的表达。这些结果表明Creb3l1能正向调控Kcnq1ot1的表达。

图 6. Creb3l1正向调控Kcnq1ot1的转录

为了验证Kcnq1ot1治疗肝硬化的潜力，作者利用来自汉恒生物的AAV9-TBG 病毒在小鼠体内对Kcnq1ot1进行了特异性敲低，然后诱导肝硬化的发生。作者发现病毒可以高效特异的敲低肝脏内的Kcnq1ot1，并有效的减轻了肝硬化程度。

图 7. 敲低Kcnq1ot1将减轻miR-374-3p/Fstl1在体内导致的肝硬化

图8. 骨髓间充质干细胞通过调控Creb3l1 / lncRNA Kcnq1ot1 / miR-374-3p / Fstl1 通路减轻肝硬化

最后，作者发现了骨髓间充质干细胞通过调控Creb3l1 / lncRNA Kcnq1ot1 / miR-374-3p / Fstl1 通路减轻肝硬化的重要机制，极大的推动了我们对肝硬化发生机制的理解，为肝硬化的缓解和治疗提供了重要的潜在治疗靶点。