基于以上发现，同济大学的研究团队在期刊《European Heart Journal》发表研究论文“Exerkine fibronectin type-III domain-containing protein 5/irisin-enriched extracellular vesicles delay vascular ageing by increasing SIRT6 stability（富含FNDC5/鸢尾素的EVs通过提高SIRT6的稳定性来延缓血管老化）”，旨在探讨FNDC5/鸢尾素在EVs中的表达及其生物学功能，研究FNDC5/鸢尾素在血管老化中的作用。值得一提的是，该文章使用了汉恒生物提供的AAV2/9-MHCK7-mFNDC5-EGFP和AAV2/ 9-TBG-mFNDC5-EGFP来研究富含FNDC5/鸢尾素的EVs的来源。

首先，作者检测了不同条件下小鼠体内和成肌细胞中FNDC5/鸢尾素的表达水平，发现与2月龄小鼠相比，24月龄老年小鼠骨骼肌和循环中FNDC5/鸢尾素蛋白水平显著降低（图1A和B），衰老小鼠主动脉组织中两种促进衰老的重要炎症因子肿瘤坏死因子-α （TNF-α）和白介素-6 （IL-6） mRNA表达显著升高。比较衰老成肌细胞（传代数30）和非衰老的成肌细胞（传代数8）的FNDC5、鸢尾素、TNF-α和IL-6的水平，与小鼠实验呈现相同的结果（图1D-F）。另外，作者使用血管紧张素II（Ang II）处理小鼠和成肌细胞促进衰老，发现小鼠和成肌细胞的FNDC5/鸢尾素表达降低（图1K-N）。这些结果表明，FNDC5/鸢尾素在自然衰老和经Ang II处理后表达降低。

图1 FNDC5/鸢尾素在自然衰老和Ang II处理条件下的表达水平

接着，作者构建了FNDC5敲除（FNDC5-KO）小鼠以探索FNDC5在血管老化中的作用。与WT小鼠相比较，发现FNDC5-KO小鼠寿命比WT小鼠短（图2A）；幼龄WT与FNDC5-KO小鼠的衰老标志物SA-β-gal染色强度无显著差异，然而，老龄FNDC5-KO小鼠主动脉SA-β-gal染色强度大于老龄WT小鼠（图2B）。FNDC5-KO小鼠比WT更易疲惫，在老年小鼠中尤为明显（图2D）。，作者发现抗衰老因子核因子红细胞2相关因子2（Nrf2）在老龄小鼠中表达下降，在老龄FNDC5-KO小鼠中下降量更明显（图2F）。检测衰老标志物γ H2A.X和p-Chk1的表达量，发现这两种物质在老龄小鼠主动脉中表达上调，FNDC5-KO小鼠中这一变化更为显著（图2H）。因此，作者认为FNDC5缺失加速老年小鼠主动脉血管老化。

图2 FNDC5缺失加速老年小鼠主动脉血管老化

为进一步研究FNDC5/鸢尾素在血管老化中的作用，作者先是使用Ang II 长期注射WT和FNDC5- KO小鼠，检测γH2A.X、p-Chk1、TNF-α、IL-6等标志物的表达量，发现FNDC5缺失会加重Ang II 诱导的血管老化，与预期相符。接着作者将WT小鼠分为两组，一组注射Ang II，另一组注射Ang II +鸢尾素，持续4周。实验结果显示，注射Ang II +鸢尾素的小鼠，SA-β-gal染色强度降低，PWV（脉波速度）值降低，弹性蛋白含量无明显降低，血管钙化减少（图3A-D），鸢尾素还抑制了γ - H2A.X、p16INK4A和促炎因子（TNF-α、Il-1α和IL-6）的表达（图3E-H）。作者利用小鼠血管平滑肌细胞系进行了体外实验，也呈现出类似的结果（图3I-M）。以上结果表明鸢尾素可以减轻Ang II诱导的血管老化。

图3 鸢尾素可以减轻Ang II诱导的血管老化

作者比较了静坐或运动的WT和FNDC5-KO小鼠在注射Ang II后血管的老化情况，发现运动显著减轻了Ang II诱导的WT小鼠衰老，但在FNDC5-KO小鼠中没有，作者推测富含FNDC5/鸢尾素的Evs加强了运动对血管老化的抑制作用。通过电镜观察和免疫印迹实验，作者发现FNDC5/鸢尾素在血液EVs中的形式与骨骼肌相同，而在肝脏和脂肪组织中则不同。因此作者构建了AAV2/9-MHCK7-mFNDC5-EGFP和AAV2/9-TBG-mFNDC5-EGFP两种病毒载体注射Ang II处理的小鼠，分别靶向骨骼肌和肝脏，，来确定哪个器官分泌的富含FNDC5/鸢尾素的EVs起延缓血管老化的作用。

作者观察到相较注射了AAV2/9-TBG-mFNDC5-EGFP和对照病毒（AAV2/9-MHCK7-null，AAV2/9-TBG-null）的小鼠，注射了AAV2/9-MHCK7-mFNDC5-EGFP的小鼠主动脉SA-β-gal染色强度减弱，γ - H2A.X、p16INK4A和促炎因子（TNF-α、Il-1α和IL-6）表达量下降，弹性蛋白含量较高，SBP（收缩压）和PWV下降（图4A-G）。提取小鼠的血管平滑肌细胞（VSMCs），结果显示，只有在注射了AAV2/9-MHCK7-mFNDC5-EGFP的小鼠EVs中检测到了FNDC5/鸢尾素（图4 H）。另外作者发现，含有FNDC5/鸢尾素的EVs恢复了VSMCs的DNA复制，抑制了TNF-α和IL-6的表达，并增加了弹性蛋白的mRNA水平（图4J-K）。这些结果表明只有注射了AAV2/9-MHCK7-mFNDC5-EGFP小鼠的EVs能抑制VSMCs的衰老。综合体内实验和体外实验的结果，作者得出骨骼肌来源的富含FNDC5/鸢尾素的EVs有助于延缓血管老化。

图4 骨骼肌来源的富含FNDC5/鸢尾素的EVs延缓血管老化

为了进一步阐明FNDC5/鸢尾素延缓血管老化的分子机制，作者检测了VSMCs中3种主要长寿基因（SIRT1，SIRT3和SIRT6），发现经鸢尾素处理后，SIRT6表达显著上调（图5A）。从运动的WT小鼠血液中提取的EVs中SIRT6表达上调，从静止的WT小鼠和静止或运动的FNDC5-KO小鼠中提取的EVs中SIRT6则蛋白表达无明显变化（图5B）。为了解FNDC5/鸢尾素如何促进SIRT6的表达，作者对经Ang II或Ang II +鸢尾素处理的VSMCs进行了RNA测序（图5C），结合RNA-Seq和qPCR分析结果，选择了几个具有潜在衰老相关功能的基因进行研究，包括mt-Co3、Gcat、Dnajb3、Ptpn7、SVIP和Serpina3n，并使用sirna介导的敲低来研究鸢尾素抗衰老作用的真正参与因子。

作者观察到，只有DnaJb3的缺失部分抑制了鸢尾素对Ang II诱导的VSMCs衰老的保护作用（图6），因此推断DnaJb3可能是FNDC5/鸢尾素抗衰老作用的关键介质。相反，VSMCs中DnaJb3的过表达与鸢尾素上调SIRT6的表达一致(图5F)，提示SIRT6可能位于DnaJb3的下游。

DnaJ蛋白，也称为Hsp40，是一种通过与Hsp70协同作用参与蛋白复合物形成的共伴侣蛋白. MG132，一种泛素-蛋白酶体途径抑制剂，也增加了SIRT6蛋白(图5F)，表明泛素化介导了SIRT6降解。这些结果表明，伴侣系统可能参与SIRT6蛋白稳定性的调控。DnaJb3过表达显著提高了SIRT6蛋白的半衰期（图5G），鸢尾素也有类似的效果（图5H）。DnaJb3过表达（图5I）和鸢尾素处理（图5J）均显著降低SIRT6泛素化。

因此，作者进一步研究了DnaJb3/Hsp40是否可以作为伴侣蛋白直接与SIRT6相互作用。共免疫沉淀分析显示，DnaJb3确实与SIRT6相互作用（图5K）。VER-155008（Hsp70拮抗剂）可抑制DnaJb3和SIRT6之间的相互作用（图5L）。缺乏SIRT6的情况下，添加鸢尾素和来自运动小鼠的EVs均不能延缓VSMCs的衰老（图5M），证实了SIRT6在鸢尾素抗衰老作用中的重要作用。这些数据表明，FNDC5/鸢尾素可能是通过一个涉及Hsp70的机制来激活DnaJ/Hsp40伴侣系统从而稳定VSMCs中的SIRT6蛋白，最终起到延缓衰老的作用。

图5 FNDC5/鸢尾素激活DnaJ/Hsp40伴侣系统稳定SIRT6

 

图6 衰老相关功能的基因敲低实验

作者观察到与45岁的人相比，70岁的人骨骼肌组织中的FNDC5蛋白水平降低了约50%（图7A），血浆中鸢尾素浓度随年龄的增长而下降（图7B）。这表明，肌肉和血浆中与运动相关的FNDC5/鸢尾素随着年龄的增长而减少。此外，血浆鸢尾素浓度与每周运动时间呈正相关（图7C），与动脉僵硬指数[包括PWV、AIX（增强指数）和PPA（脉压放大）]负相关（图7D-F）。采用全模型多元线性回归进一步检验血浆鸢尾素水平与年龄、性别、体重指数、运动时间、吸烟、酒精、收缩压、糖尿病和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）等常规心血管危险因素之间的关系，结果显示血浆鸢尾素水平与年龄、运动时间和LDL-C显著相关（见表1）。以上研究结果表明，血浆FNDC5/鸢尾素水平与人类血管老化负相关。

图7 血浆中鸢尾素浓度的降低与人类血管老化有关

 

表1 血浆鸢尾素水平与常规心血管危险因素的关系

综上，作者阐明了运动延缓心血管老化的机制，富含FNDC5/鸢尾素的EVs通过激活DNAJ/Hsp40伴侣系统来稳定VSMCs中的SIRT6蛋白，从而介导运动对血管老化的延缓作用。这一结论强调了代谢、运动和衰老之间的相互作用，并为解决人类自然衰老过程中久坐的生活方式引起的血管疾病提供了潜在的药物治疗方案。