2023年6月2日，军事科学院军事医学研究院的李慧艳研究员团队和张学敏院士团队联合在Science上在线发表了题为“Rhythmic Cilia Changes Support SCN Neuron Coherence in Circadian Clock”的研究论文。该研究发现SCN神经元的初级纤毛是调控机体节律的细胞器，揭示出“有形”生物钟的存在及其节律调控机制。此项科学突破揭示了“有形”生物钟的存在及其节律调控机制，为节律紊乱相关疾病的治疗开辟了全新路径。

值得注意的是，在本研究中，作者使用了汉恒生物提供的AAV9-Cre和AAV9-Nms-Cre病毒，成功获得了Shh和Ptch1组织特异性敲除小鼠。

在此项研究中，作者首先观测到小鼠大脑组织中大部分SCN神经元含有初级纤毛结构；进一步研究发现初级纤毛的数量和长度表现出明显的昼夜节律性，而这种节律与细胞周期无关，与具有生物钟和迁移功能的Cry1(Cryptochrome 1)蛋白的节律完全相反。此外，在生物钟表达基因Bmal1(MOP3或ARNTL)缺陷的小鼠中，初级纤毛的表达丰度的昼夜节律性消失。之后，作者在体外细胞实验中也验证了初级纤毛的长度具有昼夜节律性变化；综上表明初级纤毛的丰度和长度具有昼夜节律性。

接着，作者通过免疫荧光双染对不同的神经元和初级纤毛进行标记，发现初级纤毛主要存在于SCN神经元中的神经肽神经素S(NMS)神经元中。为了进一步探究初级纤毛在昼夜节律中的调控作用，作者通过将Nms-Cre鼠和Ift88fl/fl或Ift20fl/fl鼠进行杂交，从而获得纤毛形成所需的两个基因Ift88和Ift20敲除的小鼠，进而阻断NMS神经元中初级纤毛的形成。研究结果表明，Ift88或Ift20的缺失不会影响小鼠的发育和SCN神经元的形态。进一步在时差实验中发现，野生型小鼠需要7-9天才能适应新的时间周期，而SCN纤毛特异缺陷小鼠仅需1-2天就适应了新的时间周期。由此表明NMS神经元纤毛在昼夜节律中具有特殊的功能。接着，进一步研究表明SCN纤毛特异缺陷小鼠对周期的适应性并不受环境的影响，而是内部时钟的快速相移引起的。

图2 NMS神经元中的初级纤毛维持昼夜节律

为了进一步探究初级纤毛是否参与SCN神经元之间的细胞间偶联，作者利用Luciferase作为报告基因标记小鼠体内生物钟基因Per2，用于记录昼夜节律。研究结果显示，正常处理后对照组(Nms-Cre、Ift88fl/fl)和实验组Nms-Ift88-/-小鼠SCN的昼夜节律表现一致；利用TTX阻断SCN 神经元的细胞间偶联，发现TTX破坏了对照组和实验组小鼠SCN神经元的节律性，去除TTX后，对照组小鼠SCN神经元恢复节律，而Nms-Ift88-/-小鼠SCN神经元节律未恢复。由此表明，NMS中初级纤毛促进了SCN神经元细胞间的偶联。此外，为了验证受细胞间偶联影响的温度抵抗是否与初级纤毛有关，作者用不同的温度循环处理对照组(Nms-Cre、Ift88fl/fl)和Nms-Ift88-/-小鼠，研究结果显示，对照组小鼠节律并未发生变化，而Nms-Ift88-/-小鼠节律发生明显的移位。结果表明，无纤毛的SCN对周期性温度变化的抗性较弱；由此推测，这种抗性可能源于SCN中纤毛依赖性的细胞间偶联。

图3  初级纤毛促进 SCN 中的神经元间耦合

Shh基因在SCN神经元中广泛表达，并且Shh信号通路（Sonic Hedgehog）靶基因Gli1(GLI family zinc finger 1)和 Ptch1(patched 1)在LD（光照黑暗交替，12h）和DD（全黑暗）条件下表现出节律性振荡，而这种节律振荡在Nms-Ift88-/-小鼠或Bmal1缺陷小鼠中消失，由此推测Shh信号通路有可能在节律调节中起重要作用。紧接着，作者探究了初级纤毛介导SCN神经元细胞间偶联的机制。首先，作者借助Smo(Smoothened)敲除的小鼠Nms-Smo-/-小鼠(smoothened，Smo的富集是启动Hedgehog信号传导所必需的)阻断SCN神经元中的Shh信号，在时差实验中，Nms-Smo-/-小鼠可以立即进入LD周期；此外，作者发现SMO激动剂能促进Per2的表达，以及延迟SCN 昼夜节律振荡。接着，为了进一步验证Shh信号通路在节律调节中的作用，作者借助汉恒生物提供的AAV9-Cre病毒工具获得SCN区Shh特异性敲除的小鼠，在时差实验中Shh-/-小鼠也能立即重新进入LD周期，与之前结果一致；为了进一步探究Shh信号通路在SCN中的功能，作者借助汉恒生物提供的AAV9-Nms-Cre病毒工具，在小鼠SCN的NMS神经元中特异性敲除 Shh信号的关键负调节因子Ptch1，时差实验结果与前面一致，Ptch1-/-小鼠也能立即重新进入LD周期，由此表明Shh信号通路在NMS神经元纤毛中表现的昼夜节律中发挥重要作用。此外，作者利用单细胞实时荧光素酶发光成像技术，发现Shh信号通路可能促进SCN神经元之间的细胞间偶联。

图4  Shh信号通路维持SCN中的昼夜节律

最后，作者检测了多个核心生物钟基因(Per1, Cry1, Bmal1和Clock)和已知介导细胞间偶联的神经肽(Vip、Grp、Avp、Prok2)的节律性表达，在Nms-Ift88-/-和 Nms-Smo-/-小鼠中，核心生物钟基因和细胞间偶联的神经肽基因的节律性发生了改变，并且，在Nms-Ift88-/-和 Nms-Smo-/-小鼠中的Vip和Grp的蛋白表达显著下降。由此表明，SCN神经元的纤毛缺失导致核心生物钟基因核神经肽的振荡减弱。

图5 纤毛依赖性Shh信号调节时钟基因和神经肽的节律

综上所述， NMS神经元上的初级纤毛依赖性Shh信号通过细胞间耦合在昼夜节律调节中起关键作用，这提示靶向Shh通路的药物可能具有用于治疗生物节律破坏相关疾病的潜能。随着时代的发展与科技的进步，社会竞争和工作压力与日俱增，全球大约1/3的人存在节律紊乱问题，表现为睡眠障碍等症状。由于缺乏对生物节律调节机制的认识，当前国际上尚未能研究出基于生物节律的有效治疗药物。此次有关生物钟的重要发现，也是我国脑科学研究的一次重大突破。