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诺贝尔化学奖颁给它？一文看懂 Crispr/Cas9 技术的比较优势
人阅读 发布时间：2020-10-16 15:45
2020 年诺贝尔化学奖重磅公布，这项大奖颁给了法国微生物学家 Emmanuelle Charpentier 和美国生物学家 Jennifer Anne Doudna，以表彰她们开发了一种基因组编辑方法——Crispr/Cas9。
在过去的十几年里，RNAi 技术一直都是功能基因筛选的经典技术。但 2012 年 Crispr/Cas9 基因编辑技术问世以来，经过短短几年的发展，已经逐渐取代 RNAi 技术，成为当下最炙手可热的研究工具 [1]。下面，小恒将带领大家一起来回顾一下这两种技术，并分析一下它们的优缺点。
Crispr/Cas9
Crispr/Cas9 最早发现存在于许多原核生物的基因组中，用来抵御外源遗传物质入侵，比如噬菌体病毒和外源质粒。同时，它为细菌提供了「获得性免疫」，当噬菌体病毒入侵时，细菌就会产生「记忆」，防止携带同样遗传物质的病毒再次入侵。
这个系统的原理是 crRNA（crispr-derived RNA）通过碱基互补配对与 tracrRNA（trans-activating RNA）结合形成复合物，该复合物会引导 cas9 核酸酶识别并靶向结合到 crRNA 配对的双链 DNA 上并切割 DNA，从而实现对基因组 DNA 的编辑 [2]。而通过人工设计 crRNA 和 tracrRNA 这两种 RNA，改造成具有引导作用的 sgRNA（single guide RNA），从而引导 Cas9 对 DNA 的定点切割（图 1）。
图1：工程化的 CRISPR/Cas 系统。该系统是个二元系统：负责切割的 Cas9 核酸酶和定位用的 guide RNA （sgRNA）。
RNA 干扰（RNA interference，RNAi）是指小分子双链 RNA 可以特异性地降解或抑制同源 mRNA 表达, 从而抑制或关闭特定基因表达的现象。
这项技术的原理是双链 RNA 分子在 Dicer 酶的作用下可产生一系列长度为 21～22 个 nt 的 siRNA，siRNA 双链结合一个核酶复合物形成 RNA 诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活的 RISC 通过碱基配对定位到同源 mRNA 转录本上，并在结合部位切割 mRNA，被切割后的 mRNA 随后降解 [3]（图 2）。
图2： RNA interference，RNAi
RNAi 技术和 Crispr/Cas9 技术优缺点比较
1）从抑制基因表达的效率上来讲，RNAi 是在转录后水平降低基因表达，而 Crispr/Cas9 则可以靶向 DNA 并改变或敲除基因表达。有些时候可能需要 Crispr/Cas9 来完全敲除，以免残留的低水平蛋白表达造成任何不确定的影响。例如在癌细胞中，某些基因有多个转录本的情况下，这种完全敲除就很有效。当然，在某些情况下敲低可能是更好的选择。例如，某些基因是细胞生长所必需的，完全敲除会造成细胞致死，导致基因功能难以研究，相比之下敲低则可以更好地模拟药物对靶点的抑制。
2）从脱靶效应上来讲，RNAi 和 Crispr/Cas9 都有脱靶效应的风险。因为 shRNA 或 sgRNA 均可靶向带有互补种子区的序列，造成依赖序列的脱靶效应。此外，RNA 还表现出不依赖序列的脱靶活性。两者相比，由于 CRISPR 系统必须在转录起始位点附近才能发挥作用，其脱靶效率要远低于 RNAi。
3）从操作的难易程度上来讲，Crispr/Cas9 需要将 Cas9 和 sgRNA 一起导入细胞，而 RNAi 则不需要另外的蛋白因子，转染相对比较快速简单，能够迅速引起表型变化。不过随着技术的快速发展，递送载体和 sgRNA 设计的改进，相信未来 Crispr/Cas9 技术会得到更广泛地应用。
通过分析两者的优缺点，小恒总结出 Crispr/Cas9 有以下特点和优势：
• 靶向精确性更高。sgRNA 靶向序列必须和基因组序列完全匹配，Cas9 才会对 DNA 进行剪切。
• 可靶向 DNA 并且完全敲除基因的表达。
• 无物种限制。
• 可以实现对多个靶点同时敲除。
Reference
[1] Cong, L.; Ran, F.A.; Cox, D.; Lin, S.; Barretto, R.; Habib, N.; Hsu, P.D.; Wu, X.; Jiang, W.; Marraffifini, L.A.; et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 2013, 339, 819–823.
[2] Garneau, J.E.; Dupuis, M.E.; Villion, M.; Romero, D.A.; Barrangou, R.; Boyaval, P.; Fremaux, C.; Horvath, P.; Magadán, A.H.; Moineau, S. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature 2010, 468, 67–71
[3] Wilson, R.C.; Doudna, J.A. Molecular mechanisms of RNA interference. Annu. Rev. Biophys. 2013, 42, 217–239.
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