在经过 N 次的 PCR、酶切、连接、转化之后，阳性率依旧很低，到底是哪一步出了问题？无缝克隆，一步法构建同源重组载体或许会解决你的实验难题。
 

 
无缝克隆（Seamless Cloning/In-Fusion Cloning），区别于传统 PCR 产物克隆，差异在于载体末端和引物末端应具有 15～20 个同源碱基，由此得到的 PCR 产物两端便分别带上了 15～20 个与载体序列同源性的碱基，依靠碱基间作用力互补配对成环，无需酶连即可直接用于转化宿主菌，进入宿主菌中的线性质粒（环状）依靠自身酶系将缺口修复。
 
无缝克隆试剂盒是一种新型、快速并且高效的 Gibson Assembly DNA 定向克隆技术，可以在任意载体的任意位置一次插入多个目的基因片段。原理示意图如下：
 

 图 1. HB-infusionTM 无缝克隆试剂原理示意图

1. 线性化目的载体（左上）；2. PCR 获取目的片段。设计的引物５』需要和线性化载体末端有 15~25 bp 的重叠（图中蓝色和黄色片段，细节可参考图 3）；3. 按照一定比例把二者混合在 HB-infusionTM 的 2X 预混液内，50 ℃ 反应 20 min 后直接转化 E.coli 即可。

 
操作步骤详解

1. 制备线性化载体和插入片段

1.1. 载体制备---线性化处理

A. 质粒酶切法

在目标载体质粒上选取合适的位点进行单酶切或双酶切，对酶切后的载体进行割胶纯化。

注：

B. 质粒 PCR 法
 

 

图 2. PCR 法线性化载体示意图。在插入位点两侧设计一对方向相反的引物对载体进行扩增，通过跑胶回收获取线性化载体片段。

 
选取合适的位点，设计正向和反向引物直接进行载体质粒的 PCR 扩增，一般载体长度均大于 3 kb，建议采用高保真的 DNA 聚合酶扩增。为了避免模板质粒 DNA 对后续试验的影响，建议对 PCR 扩增后的线性化载体进行割胶纯化，去除环状模板质粒，提高阳性率。
 
1.2. 目的插入片段制备

设计引物进行目的片段 PCR 扩增，引物设计要保证目的片段两端有 15~25 bp 序列与线性化载体的两端一致（重叠序列的 Tm³48 °C，可以简单假设 A-T 碱基对=2 ℃，G-C 碱基对=4 ℃）便于拼接反应的进行。PCR 引物包括 5』端与载体同源的 15~25 bp 以及目的片段特异性序列 20~25 bp（见下图 3）。PCR 产物经跑胶纯化待用。

图 3. 采用 HB-infiusionTM 试剂盒时 PCR 上下游引物设计示例。针对双酶切法线性化载体设计插入片段的 PCR 引物，其重叠区域为 15~25 bp+酶切位点，这样重组成功的质粒上会完好保留此两个酶切位点。如果是 PCR 法线性化载体，扩增插入片段的 PCR 引物 5』端直接设计成与线性化载体末端 15~25 bp 重叠即可。

 
2. 冰上融化并且充分混匀 HB-infusionTM Master mix，配制反应体系
 

 
3. 上述反应体系置于 50 ℃ 孵育 20 min（2～3 个片段拼接）/60 min（4～6 个片段拼接）。反应完成之后如不能马上进行后续操作可将反应样品暂储存于-20℃。

4. 转化感受态菌

4.1. 在冰上融化一支 50 μl 的 DH5a 感受态菌 (配合汉恒生物专门为该试剂盒研制的感受态细胞，效果更佳)。

4.2. 取 2 μl 第 3 步中的反应样品加入融化好的感受态菌中，轻轻混匀，不能震荡混匀。将该混合物置于冰上 30 min。

4.3. 轻轻摇匀后放入 42 ℃ 水浴中 1~2 min 进行热激，然后迅速放回冰中，静置 3~5 min。

4.4. 在超净工作台中向上述各管中分别加入 500 μl LB 培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上 37℃ 震荡 1 h，摇床转速 250 rpm。

4.5. 在超净工作台中取上述转化混合液 100~300 μl，分别滴到含合适抗菌素的固体 LB 平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀（注意：玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂）。37 ℃ 培养箱中培养过夜。

4.6. 挑取平板上的克隆进行 PCR 或者酶切鉴定。



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