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LncRNA系统研究解决方案
人阅读 发布时间：2017-08-22 10:49
一、LncRNA的背景知识
lncRNA(Long noncoding RNAs, LncRNAs)长链非编码RNA， 起初被认为是基因组转录的“噪音”，是RNA聚合酶II转录的副产物，不具有生物学功能。然而，近年来的研究表明，lncRNA参与了X染色体沉默（图1A），基因组印记以及染色质修饰，转录激活（图1B），转录干扰，核内运输等多种重要的调控过程，lncRNA的这些调控作用也开始引起人们广泛的关注。哺乳动物 基因组序列中4%~9%的序列产生的转录本是lncRNA（相应的蛋白编码RNA的比例是1%），虽然近年来关于lncRNA的研究进展迅猛，但是绝大部分的lncRNA的功能仍然是不清楚的，随着研究的推进，各类 lncRNA 的大量发现，lncRNA 的研究将是 RNA 基因组研究非常吸引人的一个方向，使人们逐渐认识到基因组存在人类知之甚少的“暗物质”。
图1A：LncRNA参与X染色体的沉默；B：LncRNA参与基因的转录激活。
图2、LncRNA的8中作用方式
三、LncRNA研究总体策略
（1）、差异性的LncRNA的筛选
A、生物信息学预测
根据客户提供的转录组信息，根据基因特征，通过与数据库比较，去除以知可能蛋白编码转录本、tRNA、rRNA、repeat等预测可能的LncRNA
B、高通量的表达谱芯片
表1、高通量的表达谱芯片
C、新一代的测序
具有现代的DNA测序技术的快速测序速度已经有助于达到测序完整的DNA序列。
通过逆转录法，将LncRNA逆转录成cDNA，确定某一段序列，再通过RACE方法，确定已知序列的两端的序列。
（2）、生物信息学分析
A、新的LncRNA的预测
B、LncRNA表达差异分析
C、LncRNA的功能分析（mRNA、蛋白和miRNA）
可以通过LncRNA-mRNA/miRNA共表达谱，分析LncRNA可能调控的蛋白或者miRNA。以
及通过网络数据库miR CODE、Cat RAPID等进行预测LncRNA可能调控的miRNA和蛋白。
图3、miRcode数据库
图4、CatRAPID数据库
图5、RIP技术流程
lncRNA(Long noncoding RNAs, LncRNAs)长链非编码RNA， 起初被认为是基因组转录的“噪音”，是RNA聚合酶II转录的副产物，不具有生物学功能。然而，近年来的研究表明，lncRNA参与了X染色体沉默（图1A），基因组印记以及染色质修饰，转录激活（图1B），转录干扰，核内运输等多种重要的调控过程，lncRNA的这些调控作用也开始引起人们广泛的关注。哺乳动物 基因组序列中4%~9%的序列产生的转录本是lncRNA（相应的蛋白编码RNA的比例是1%），虽然近年来关于lncRNA的研究进展迅猛，但是绝大部分的lncRNA的功能仍然是不清楚的，随着研究的推进，各类 lncRNA 的大量发现，lncRNA 的研究将是 RNA 基因组研究非常吸引人的一个方向，使人们逐渐认识到基因组存在人类知之甚少的“暗物质”。
图1A：LncRNA参与X染色体的沉默；B：LncRNA参与基因的转录激活。
二、已知的几种LncRNA的作用方式
1) 在编码蛋白基因的上游启动子区（橘色）转录，从而干扰邻近蛋白编码基因（蓝色）的表达（如酵母SER3基因）；
2) 抑制RNA 聚合酶Ⅱ，或介导染色质重构和组蛋白修饰，而影响基因（蓝色）表达；
3) lncRNA（紫色）与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，干扰mRNA的剪切，进而产生不同的剪切形式；
4) lncRNA（紫色）与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，在Dicer酶作用下产生内源性的siRNA，调控基因的表达水平；
5) lncRNA（绿色）结合在特定蛋白质上调节相应蛋白的活性；
6) 作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体；
7) 结合在特定蛋白上从而改变该蛋白的胞质定位；
8) 可作为小分子RNA（如miRNA）的前体分子或者miRNA的反义抑制分子。
1) 在编码蛋白基因的上游启动子区（橘色）转录，从而干扰邻近蛋白编码基因（蓝色）的表达（如酵母SER3基因）；
2) 抑制RNA 聚合酶Ⅱ，或介导染色质重构和组蛋白修饰，而影响基因（蓝色）表达；
3) lncRNA（紫色）与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，干扰mRNA的剪切，进而产生不同的剪切形式；
4) lncRNA（紫色）与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，在Dicer酶作用下产生内源性的siRNA，调控基因的表达水平；
5) lncRNA（绿色）结合在特定蛋白质上调节相应蛋白的活性；
6) 作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体；
7) 结合在特定蛋白上从而改变该蛋白的胞质定位；
8) 可作为小分子RNA（如miRNA）的前体分子或者miRNA的反义抑制分子。
图2、LncRNA的8中作用方式
三、LncRNA研究总体策略
（1）、差异性的LncRNA的筛选
A、生物信息学预测
根据客户提供的转录组信息，根据基因特征，通过与数据库比较，去除以知可能蛋白编码转录本、tRNA、rRNA、repeat等预测可能的LncRNA
B、高通量的表达谱芯片
| Species | Size | Database | Capacity |
| Mouse | 40k | RefSeq 60，UCRs，LncRNAdb | 40k |
| Rat | 90k | RefSeq 60，FANTOM3，LncRNAdb | 60k |
| Human | 40k | RefSeq 60，H-InvDB，LncRNAdb，John Rinn，GENCODE lncRNA | 12k |
C、新一代的测序
具有现代的DNA测序技术的快速测序速度已经有助于达到测序完整的DNA序列。
通过逆转录法，将LncRNA逆转录成cDNA，确定某一段序列，再通过RACE方法，确定已知序列的两端的序列。
（2）、生物信息学分析
A、新的LncRNA的预测
B、LncRNA表达差异分析
C、LncRNA的功能分析（mRNA、蛋白和miRNA）
可以通过LncRNA-mRNA/miRNA共表达谱，分析LncRNA可能调控的蛋白或者miRNA。以
及通过网络数据库miR CODE、Cat RAPID等进行预测LncRNA可能调控的miRNA和蛋白。
图3、miRcode数据库
图4、CatRAPID数据库
（3）、LncRNA的功能研究
A、LncRNA的表达变化
利用QPCR、FISH等技术，在各种细胞、动物模型中，检测LncRNA在细胞和组织水平的分布和变化。
B、Gain of Function（体内和体外）
利用质粒载体或者病毒载体（慢病毒、腺病毒等）全长过表达LncRNA（汉恒生物提供lncRNA病毒包装服务）
C、Loss of Function（体内和体外）
合成片段siRNA;
质粒载体或者病毒载体（慢病毒、腺病毒等）表达shRNA;（汉恒生物提供lncRNA病毒包装服务）
ASO（antisenseoligonucleotide，反义寡核苷酸），主要针对细胞核内的反义RNA起作用。
D、LncRNA沉默与定位分析(Combined knockdown and localization analysis of noncoding RNAs, c-KLAN)技术
（4）、LncRNA的调控机制研究
A、表观遗传-DNA甲基化
利用MSP、BSP技术，研究LncRNA对DNA甲基化的调控。
B、表观遗传-染色质重塑
利用ChIP技术，研究LncRNA对染色质重塑的调控。
C、转录调控
通过EMSA、RIP（图5）、ChIRP、Co-IP等技术，研究LncRNA与转录因子间的相互作用。
A、LncRNA的表达变化
利用QPCR、FISH等技术，在各种细胞、动物模型中，检测LncRNA在细胞和组织水平的分布和变化。
B、Gain of Function（体内和体外）
利用质粒载体或者病毒载体（慢病毒、腺病毒等）全长过表达LncRNA（汉恒生物提供lncRNA病毒包装服务）
C、Loss of Function（体内和体外）
合成片段siRNA;
质粒载体或者病毒载体（慢病毒、腺病毒等）表达shRNA;（汉恒生物提供lncRNA病毒包装服务）
ASO（antisenseoligonucleotide，反义寡核苷酸），主要针对细胞核内的反义RNA起作用。
D、LncRNA沉默与定位分析(Combined knockdown and localization analysis of noncoding RNAs, c-KLAN)技术
（4）、LncRNA的调控机制研究
A、表观遗传-DNA甲基化
利用MSP、BSP技术，研究LncRNA对DNA甲基化的调控。
B、表观遗传-染色质重塑
利用ChIP技术，研究LncRNA对染色质重塑的调控。
C、转录调控
通过EMSA、RIP（图5）、ChIRP、Co-IP等技术，研究LncRNA与转录因子间的相互作用。
图5、RIP技术流程
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