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如何用 cas9 做敲入?

人阅读 发布时间:2021-11-05 17:48

Cas9 介导同源重组(HDR)除了需要多引入一条修复模板(repair template),基本操作和做基因敲除(KO)基本一致(Fig 1)。顺利的情况下整套操作下来至少需要 4 周时间(心急吃不到热豆腐嘞~~),其中单克隆的获取和鉴定是最大的限速步骤。

 

WT 的 Cas9 (这里指 spCas9)是引起双链断裂(DSB),进而引起 NHEJ(nonhomologous end joining,意思就是断裂的末端重新连起来,这一过程容易产生 indels)或者 HDR(修复模板存在);但有一个突变体(D10A)却只保留了切口酶的活性(nickase) (spCas9n),一般不会引起 NHEJ,但会引起 HDR(修复模板存在)。大家周知 WT 的 spCas9 会有些微的脱靶效应,因此利用 cas9n 代替 WT 的 cas9 产生 deletion(需要两条 sgRNA 同时作用)或者 HDR 可以降低一部分脱靶的效果(Fig. 2)。

 

 


 Fig 1. Cas9敲除/敲入基因时间安排


Fig 2. Cas9 (D10A)突变体(Cas9n)只保留 nickase 活性



 

这一突变体不会引起 NHJE。如果同有两条 sgRNA 靶向一个 gene 的不同位点,Cas9n 会引起一个片段(两个 sgRNA 之间)的 deletion。修复模板存在的情况下可以引起 HDR。

 

今天的内容主要讲讲利用 Cas9 怎么做同源重组(修复)(HDR)。其实基因的敲入(KI)也是一模一样的做法。

 

 

 如何利用 Cas9 做同源重组 


 

 一、同源臂的设计

 

 和做 KO 比较,做 HDR 最大的不同就是要有同源模板的存在。同源模板有以下两种类型 (Fig. 3):

 

1、单链模板:手动设计单侧同源臂长度不低于 40 nt,但强烈推荐设计~90 nt。找引物合成公司合成较长单连 oligo 即可 (90+90+Insertion),针对正链或者反链合成都 ok。没有必要使用 PAGE 纯化。为了验证方便,建议引入酶切位点(RFLP 法)。当然,同源模板也可以是线性化的双链 DNA 片段,可以通过线性化载体或者基因合成 / PCR 获得。溶解成终浓度 10 mM,-20°C 分装保存。
2、线性化双链模板:同源臂在 1000 nt 左右;线性化载体或者 PCR 产物作为转染模板。


 

二、转染

★ 12 孔板:2 ✕ 105 cells/well (50-70% confluency)

★ 500 ng Cas9(或者 Cas9n)-sgRNA

★ 1 μl 单链同源模板(10 μM)

 

三、 鉴定方法

 

通过 GFP 或者 puromycin 富集成 mixture,然后直接 PCR 测序或者利用 Restriction-fragment length polymorphism (RFLP) 分析方法。

 

  四、结论

 

1、WT 的 Cas9 直接切割双链,引起 DSB,重组效果最好,但会引起脱靶;
2、单链 oligo 作为模板优于线性化载体作为模板; 
3、貌似反义 oligo 的模板效果优于正链。 





 

参考文献:

1. Ran FA, Hsu PD, Wright J, Agarwala V, Scott DA, and Zhang F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 2013;8(11):2281-308.

2. Wang H, Yang H, Shivalila CS, Dawlaty MM, Cheng AW, Zhang F, and Jaenisch R. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 2013;153(4):910-8.

3. Wu Y, Liang D, Wang Y, Bai M, Tang W, Bao S, Yan Z, Li D, and Li J. Correction of a genetic disease in mouse via use of CRISPR-Cas9. Cell Stem Cell. 2013;13(6):659-62.

4. Swiech L, Heidenreich M, Banerjee A, Habib N, Li Y, Trombetta J, Sur M, and Zhang F. In vivo interrogation of gene function in the mammalian brain using CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol. 2015;33(1):102-6

5. Ran FA, Cong L, Yan WX, Scott DA, Gootenberg JS, Kriz AJ, Zetsche B, Shalem O, Wu X, Makarova KS, et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 2015;520(7546):186-91.

6. Nelson CE, Hakim CH, Ousterout DG, Thakore PI, Moreb EA, Castellanos Rivera RM, Madhavan S, Pan X, Ran FA, Yan WX, et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 2016;351(6271):403-7.

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