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从质粒构建教你做基因敲除

人阅读 发布时间:2020-11-24 15:35

lentiCRISPR v2 载体是张锋实验室发布的一个慢病毒载体,cas9 和 sgRNA 表达框在同一个载体上,而且 Cas9 的 C 端带有 FLAG 融合标签,载体包含 Puromycin 抗性基因,适合建系。验证 sgRNA 活性的时候也适合瞬转;包装成慢病毒适合常规细胞系的建系,构建非常方便。
 
 

 LentiCRISPR v2 应用指南 

 

网址:https://www.addgene.org/52961/
 

 

克隆 gRNA 使用 BsmBI 位点,载体可以切出一个 ~1.9 kb 的 filler 片段,便于 confirm 酶切成功并利于载体回收;

 

BsmBI 的位点是       ,酶切之后不需要 CIP 脱磷也不会自连!

 

Cas9 的 C 端带有 FLAG tag,可以 WB 或者 Immunostaining

 

EF1-a promoter 被优化的小而强,极大提高了慢病毒包装的效率

 

载体带有 Puromycin 抗性,可以富集转染/感染成功的细胞。

 

 如何设计 gRNA 
 

gRNA 设计方法和原则请参考上第一步「lentiCRISPR v2 应用指南」,链接如下:https://www.addgene.org/52961/

对于 lentiCRISPR v2 克隆,其合成的 oligo 末端和 pX330 不同,请注意设计:
 


举个例子说明(克隆小白千万注意 oligo 的方向):
 




 如何克隆载体 


Backbone 的酶切体系同上方步骤「如何设计gRNA」(说明:不脱磷处理参考黑框,脱磷参考红框内操作)

Oligo 的退火条件也参考上方步骤(说明:如果载体不脱磷,oligo 不需要磷酸化;载体脱磷参考红框内操作,oligo 就需要加磷处理!!!(红色框内是 FengZhang 提供的 protocol,设计脱磷,仅作为参考)


仅作参考




 病毒包装体系 


包装病毒使用的包装体系如下(for 100 mm dish,6x106  293T)

转染条件:用汉恒生物的细胞转染试剂 LipoFiter™

 

收集 48hr 和 72hr 病毒上清,待用。

病毒包装的 protocol 非常多,小编只列了基本的信息。后续会出详细写慢病毒包装步骤的干货!

 

 目的细胞系的感染/转染 


转染 (2 μg  plasmid/60 mm dish,细胞密度 60-80%)

【v2=lentiCRISPR v2,下同】



感染 (1-5 ml病毒上清)【v2=lentiCRISPR v2,下同】 



PCR 测序产生的套峰示意图



KO 单克隆的获取
 

单克隆的挑取---单克隆可以有限稀释到 96-well plate(~30 cells/plate)(293T、HeLa、MEF 等细胞系推荐使用)。如果编辑效率50%,推荐分两块 plate 即可,最终拿到 20-30 个单克隆一般可以得到成功 KO 的细胞系;或者铺到 100 mm dish 里,一周后挑取单克隆(这种方法适合单细胞不容易成活的细胞系如,但是挑取的单克隆偶尔不纯,有时需要重新亚克隆)。

单克隆的鉴定---根据设计,推荐使用酶切鉴定的方法(见设计部分),通量高;如果抗体比较好用,推荐使用WB检测蛋白,这种方法最彻底;最末一种方法就是直接测序鉴定,该种方法费时费力费钱,建议设计时尽量避开。

有限稀释法(悬浮细胞适用此法)---50-100 cells 均匀分到 96-well plate

 

单克隆挑取法
 
 

KO 单克隆的鉴定

 

 

直接测序或者酶切鉴定

抽取 genomic DNA,然后 PCR 测序或者或者酶切鉴定
 


WB 鉴定

如果抗体好用,直接用 dot blot 或者免疫荧光染色可以,速度快,通量高。当然普通 WB 也可以。
 


汉恒生物拥有丰富敲除细胞系构建经验,可以实现彻底敲除目的基因的目标


我们的优势:

 

·种子优良--严选低代数细胞来源,无支原体无黑胶虫
汉恒生物所有的细胞均从中科院细胞库购买,代数低无污染,还可以提供 STR 检测报告。


·简单高效--慢病毒系统,提高感染效率,缩短实验周期
汉恒生物采用慢病毒系统转染目的细胞,提高感染效率,更高效快速的挑选 KO 细胞。


·性状稳定--严酷的筛选及靶基因敲除验证体系
汉恒生物所有的敲除单克隆都通过构建T载体进行测序验证,清晰看出 DNA 序列的具体变化,确保敲除性状稳定不恢复。


·活力无损--严格的质控指标,建系后连续 3 代细胞增殖活力评估

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