重组腺相关病毒载体(rAAV)由于安全性高、免疫原性低、宿主范围广、表达时程长、在体感染特异性好等优点，被称为目前最适合在体研究基因功能的利器。

 

重组AAV递送基因疗法的一个重要方向是CNS，包括眼睛和大脑。眼睛由于个体小、相对封闭、具备免疫赦免特性，成为基因治疗中非常热门的器官，眼部疾病错综复杂，基因治疗的兴起为遗传性眼部疾病（如视网膜色素变性、Leber先天性黑朦等），甚至病理性眼部疾病（如视网膜病变等），以及其他眼部疾病（视神经损伤）的治疗带来希望。

 

美国食品药品监督管理局FDA于2017年批准了第一个rAAV 药物 Luxturna（AAV2），用于治疗遗传性视网膜营养不良，治疗费用为85万美元/双眼。这一基因疗法的批准，代表了临床医学的显著进步，是人类探索基因治疗的一小步，更是人类在摆脱遗传基因控制的一大步。

 

2019年7月25 日，基因编辑大神张锋等人创立的Editas Medicine和艾尔建（Allergan）联合宣布：正式启动CRISPR疗法AGN-151587 (EDIT-101)的I/II期临床试验。用于治疗Leber先天性黑蒙10(LCA10)。这是全球首例CRISPR基因编辑的在体给药治疗遗传性眼部疾病。艾尔建（Allergan）和Editas Medicine用里程碑形容这一事件。

 

人和哺乳动物体内的脂肪组织可分为白色脂肪组织和棕色脂肪组织。白色脂肪广泛分布于皮下组织和内脏周围。棕色脂肪主要是在新生儿和幼小的哺乳动物体内。成人体内虽然仅剩少量的棕色脂肪，但仍对生理上的新陈代谢具有相当大的影响。脂肪的研究对预防和治疗糖尿病、肥胖等代谢性疾病具有重大意义。

 

为了更高效更特异的的感染视网膜及视网膜穆勒细胞，科学家通过对现有血清型的衣壳蛋白进行分析，研发出了视网膜特异性血清型AAV-anc80L65和视网膜穆勒细胞特异性血清型AAV-shH10。另外为了增加病毒感染视网膜及脂肪的特异性，也研发出了视网膜的特异性启动子rpe65和脂肪的特异性启动子FABP4 (aP2)。接下来我们通过相关文献解析一下这两种新的血清型以及两种特异性启动子的AAV分别在视网膜和脂肪中的特异性感染。

 

一、anc80L65血清型AAV高效感染视网膜

 

参考文献：Synthetic adeno-associated viral vector efficiently targets mouse and non-human primate retina in vivo

 

实验方法及结果：

作者分别在小鼠视网膜下腔注射AAV2、AAV8和Anc80L27、Anc80L65、Anc80L121，其中Anc80为先前报道的研究人员对75种灵长类AAV的衣壳蛋白氨基酸序列进行分析，建立了病毒家族的进化树，确定了它们的共同祖先Anc80。研究人员列出了Anc80所有可能的序列，并根据其组装病毒颗粒的能力，人工合成了多个Anc80变体，本研究的目的是进一步研究Anc80L65和Anc80衣壳的其它2个变体以及野生AAV血清型用于视网膜基因递送的靶向性。A为成年小鼠在AAV注射4周后，眼底成像显示GFP的荧光水平。B为注射4周后视网膜共聚焦图像，显示视网膜色素上皮细胞和光感受器细胞的转导比较。细胞核用DAPI染色(蓝色)。RPE：视网膜色素上皮；ONL：外核层；INL：内核层；GC：神经节细胞。C为(B图)的INL区域的高倍放大图，显示内核神经元和胶质细胞的转导。

 

 

 

结果分析：

Anc80L27、Anc80L65和AAV8的转基因表达强度较高，而Anc80L121和AAV2的表达强度较低。所有三种Anc80变体和AAV8都能在不同的水平上靶向RPE和光感受器细胞，AAV2也有RPE靶向性。如图C所示，Anc80靶向大量的内核层(INL)细胞，AAV8也靶向部分内核层(INL)细胞。说明Anc80L27、Anc80L65和AAV8对视网膜的靶向性更高。

 

由于视网膜基因治疗的许多应用依赖于锥体光感受器的有效转导，这些特殊的细胞负责高灵敏度和彩色视觉，因此有效的锥体细胞靶向性对于视网膜基因治疗是至关重要的。因此作者又做了Anc80变体与其它野生AAV血清型在锥体细胞中的转导效率的比较及在体表达时间的比较。下图中绿色表示GFP感染的光感受器细胞的效率，红色表示锥体细胞蛋白的免疫荧光。

 

 

 

 

结果分析：

在小鼠视网膜中，Anc80L65与其他AAVs相比，具有更高的锥光受体亲和力。值得注意的是，Anc80L65的表达更快，在第1天就可见表达，在第3天mRNA水平稳定。Anc80在穆勒神经胶质细胞、视网膜神经节细胞和INL神经元中表现出明显的转导模式。最后，在恒河猴上，Anc80L65也表现了同样的效果。研究结果支持使用Anc80L65进行视网膜基因递送的治疗。Anc80L65除了视网膜靶向性，还有内耳、骨骼肌、肝脏靶向性。

 

 

二、shH10血清型AAV高效感染视网膜穆勒细胞

 

参考文献：AAV-mediated gene therapy in Dystrophin-Dp71 deficient mouse leads to blood-retinal barrier restoration and oedema reabsorption

 

实验方法及结果：

Dp71属于肌萎缩蛋白超家族，是DMD基因的短产物，是一种膜结合的细胞骨架蛋白，在视网膜的胶质和血管功能中起重要作用。Dp71主要定位于穆勒细胞，与血-视网膜屏障(blood retinal barrier, BRB)密切相关。在本研究中，作者在Dp71缺陷小鼠中使用shH10血清型腺相关病毒将Dp71基因递送到参与BRB维持的穆勒细胞，恢复了Dp71基因的表达，从而增加视网膜血管通透性。图A为穆勒胶质细胞中Dp71及Dp71相关蛋白的再定位。B为 Dp71过表达后Dp71缺失小鼠视网膜冰冻切片。

 

 

结果分析：

ShH10血清型腺相关病毒，能够有效和特异性地在dp71缺失的小鼠视网膜上靶向穆勒细胞。外源性Dp71在穆勒细胞中强而特异性的表达，可以使Dp71蛋白正确定位，恢复所有蛋白的相互作用，从而重建正常功能的BRB和视网膜稳态，从而防止视网膜水肿。

 

 

三、视网膜特异性启动子rpe65介导的视网膜特异性表达

 

参考文献：Restoration of vision in RPE65-deficient Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium

 

实验方法及结果：

作者使用RPE65特异性启动子和靶向视网膜色素上皮细胞的4型（rAAV2/4）腺相关病毒，注射犬的视网膜下腔，过表达RPE65基因，对RPE65缺陷犬进行基因治疗，RPE65基因突变会导致视网膜感光细胞（色素细胞）逐渐失去功能并坏死，最终导致视觉功能的完全丧失。a为对照眼的RPE65基因的免疫荧光（红色）；b为注射病毒治疗的眼睛；c为没有治疗的眼睛。

 

 

 

结果分析：

实验结果显示RPE65特异性启动子可高效感染视网膜，使RPE65基因高效表达并恢复了犬的视力。

 

 

 

四、脂肪的特异性启动子FABP4 (aP2)介导的脂肪特异性表达

 

参考文献：HOXC10 suppresses browning of white adipose tissues

 

实验方法及结果：

作者构建AAV8-aP2-FLAG-HOXC10载体，血管内注射，在小鼠脂肪过表达HOXC10基因。

 

 

结果分析：

实验结果显示脂肪特异性启动子FABP4 (aP2)可高效感染褐色脂肪BAT、皮下脂肪SubQ、内脏脂肪VISC，使HOXC10基因高效表达。

 

 

腺相关病毒的低免疫原性配合组织特异性启动子实现基因的定向递送，极大提高了其对特定组织的感染效率，也大大增强了实验的成功率。

 

汉恒目前针对神经、肌肉、肝脏等组织，研发几十余种特异性启动子及特异性血清型，充分满足大家的实验需求~