做过分子实验的人可能都会有这样的经历：在经过N次的PCR、酶切、连接、转化之后，阳性率依旧很低，到底是哪一步出了问题？今天就给大家详解一下可以一步法快速构建同源重组载体，并且阳性率很高的方式：无缝克隆。

 

无缝克隆技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA的片断的插入，而不需要任何限制性内切酶和连接酶。突破传统的双酶切再加上连接，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体，大大提高了工作效率。

 

我们先来将传统克隆与无缝克隆做下比较：




 

 

 

无缝克隆相较于传统克隆的方式，『优势』显而易见，，主要体现以下几点：

 

1、 可以不需要任何限制性内切酶、连接酶，也不需要磷酸化、末端补平等操作；

2、 可同时连接多个DNA片段，最多可达10个；

3、 不附加任何多余序列，精确定向连接；

4、 体系反应时间仅需20min，快速反应。

 

那无缝克隆到底应该怎么做呢？下面我们就来详细了解下无缝克隆其原理：

在基因克隆的引物设计及目的DNA片段的扩增阶段，与常规PCR法是相同的。差异在于载体末端和引物末端应具有15-20个同源碱基，由此得到的PCR产物两端便分别带上了15-20个与载体序列同源性的碱基。


 

 

在用无缝克隆方式进行分子克隆时，主要操作步骤分为以下3点：

1、线性化目的载体（图1左上）：用酶切或是PCR方式

 

1） 质粒酶切法
在目标载体质粒上选取合适的位点进行单酶切或双酶切，对酶切后的载体进行割胶纯化。

2） 质粒PCR法

如果没有合适的酶切位点，你也可以通过PCR方法实现载体的线性化。


 

 

在插入位点两侧设计一对方向相反的引物对载体进行扩增，通过跑胶回收获取线性化载体片段

2、PCR获取目的片段，设计的引物5‘端需要和线性化载体末端有15-25bp的重叠



 

 

针对双酶切法线性化载体设计插入片段的PCR 引物，其重叠区域为15~25 bp+酶切位点，这样重组成功的质粒上会完好保留此两个酶切位点。如果是PCR 法线性化载体，扩增插入片段的PCR引物5’端直接设计成与线性化载体末端15~25 bp 重叠即可。

 

3、 按照一定比例把二者混合在HB-infusion™的2×预混液内，50℃反应20min后直接转化E.coli即可
反应体系如下：


 

 

通过以上三步，就可以完成质粒重组。只要再进行后续的转化感受态等操作，就可以完成载体构建。

 

当然，这么简单高效的分子克隆方式， 怎么能少了汉恒生物的HB-infusion^TM无缝克隆试剂盒呢！

 

无论你是要做简单的克隆，还是多片段克隆或者突变体克隆，包括载体改造和crispr载体构建等都可以用到汉恒生物的无缝克隆试剂盒。

 

汉恒实例分享一：小片段（1kb）和大片段（4kb）基因克隆比较


 

 

汉恒实例分享二：6个片段克隆比较


 

 

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