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萤光素酶检测原理及研究应用

人阅读 发布时间:2019-11-28 14:43

萤光素酶(Luciferase:是自然界中能够产生生物发光的酶的统称,其中最有代表性的是来自萤火虫体内(Firefly)和海肾(Renilla)体内的两类萤光素酶,萤光素酶可以催化特定的萤光素底物转变成氧萤光素,同时发出强烈的光。

萤火虫萤光素酶firefly LuciferaseF-Luc), 61kDa,可催化 D-萤光素发出萤光
海肾萤光素酶Ranilla luciferaseR-Luc), 36kDa,可催化腔肠素发出萤光
 


 

特点:

 

1. 底物存在时,催化底物发出萤光

2. 萤光亮度和萤光素酶的量成正比
 


根据荧光强度,反应表达载体上 F-luc 的表达量
 

那么萤光素酶在我们的实验中一般有什么应用呢?

转录因子结合位点与启动子活性分析

转录因子(Transcription factors,TF)是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子,也称为反式作用因子,转录因子仅与其靶启动子中的特异顺序结合,从而增强其下游基因的表达。

萤光素酶报告基因实验是检测这类转录因子及其靶启动子中特异序列结合的重要手段

 


检测原理:

 

把转录因子构建到真核表达载体上进行过表达,启动子区段构建到萤光素酶报告载体上的 F-Luciferase 上游,持续性表达 R-Luciferase 的载体作为内参,共同转染到细胞内测定萤光素酶值,分析 F-Luciferase 活性即可反应转录因子与启动子结合后启动子的活性高低。
 


 

miRNA 靶结合位点验证:

miRNA 是一类由内源基因编码的长度约为 22 个核苷酸的非编码单链 RNA 分子,通过靶向结合目的基因的结合位点(通常位于基因的3端非编码区——3’UTR区),抑制其上游基因的表达

鉴于 miRNA 的特点及 luc 的特性。miRNA 及其靶结合位点的验证可以通过双萤光实验来实现:包括 miRNA 与其靶点相关分析,miRNA 靶基因验证、lncRNA 与 circRNA 吸附 miRNA 验证等
 


 

检测原理:

把 miR 潜在结合构建到报告载体上 F-Luciferase 下游,将报告载体与 miR 的 mimics 共同转染到细胞内测定萤光素酶值,分析 F-Luciferase 活性即可反应 miRNA 与结合位点的结合特性
 

 

传统的萤光素酶检测往往通过外包给生物技术类公司的方式,尽管节省了一些人力成本,但也无可避免的具有周期长、成本高的缺点。针对这一难题,汉恒生物特别推出了

 

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