汉恒生物科技(上海)有限公司 品牌商

10 年

手机商铺

商家活跃:
产品热度:
品牌商

汉恒生物科技(上海)有限公司

入驻年限:10 年

  • 联系人:

    技术支持

  • 所在地区:

    上海

  • 业务范围:

    试剂、技术服务

  • 经营模式:

    生产厂商 科研机构

在线沟通

公司新闻/正文

circRNA 研究方案及案例解析

人阅读 发布时间:2019-10-31 15:51

circRNAs(Circular RNAs,环状 RNA 分子)是一类不具有 5' 末端帽子和 3' 末端 poly(A) 尾巴、并以共价键形成环形结构的非编码 RNA 分子。circRNA 是区别于传统线性RNA的一类新型 RNA,具有闭合环状结构,大量存在于真核转录组中。


大部分的环状 RNA 是由外显子序列构成,在不同的物种中具有保守性,同时存在组织及不同发育阶段的表达特异性。由于环状 RNA 对核酸酶不敏感,所以比线性 RNA 更为稳定,这使得环状 RNA 在作为新型临床诊断标记物的开发应用上具有明显优势。
 

 汉恒 circRNA 环化系统,表达倍数高,100% 成环
 

 

我们已知的 circRNA 功能有如下三种:1)调节 miRNA 活性-ceRNA 作用模式;2)调节选择性剪接(alternative splicing)-与 pre-mRNA 竞争剪接;3)调节 RNA 结合蛋白(RBPs)的存储,分类和定位-与蛋白直接结合;
上述三种 circRNA 机制作用方式,2)和3)由于需要用到 RIP 或 RNA pull-down,实验执行难度大风险高,而 1)调节 miRNA 活性-ceRNA 作用模式的可行性及阳性率较高,是目前研究最热门的 circRNA 作用方式。

目前对于circRNA的研究还只是冰山一角,circRNAs 的生物学功能也有待挖掘,因此是非常值得深入的研究方向。我们先来看看常规的 circRNA 研究思路(图 1)
 

图1 circRNA常规研究思路

 

 

  汉恒生物为了更好的帮助各位开展circRNA 的研究课题,我们的研究团队提出了基于ceRNA调控机制的circRNA系统研究方案。大致流程如下:
 

图 2. 汉恒生物 circRNA 研究流程示意图
 

我们以 hsa_circ_000244 为例,来详细解读下 cirRNA 的系统研究方案。研究方向:前列腺癌。

1、验证 circRNA 的表达水平


 

以前列腺癌组织和癌旁组织的 cDNA 为样本,qPCR 验证 hsa_circ_000244 的表达量及是否成环。汉恒生物拥有的 circRNA-qPCR 验证技术,可设计特殊的 circRNA 验证引物,既可验证 circRNA 表达水平,同时又能区分成环与未成环 RNA。

2、预测 has-circ-000244 可能结合的 miRNAs
 



3、miRNAs 信息学筛选及荧光素酶筛选验证

将 hsa_circ_000244 序列克隆构建至报告基因载体 psiCHECK,合成上述预测到的 miRNAmimics 及对照,在 293 T 细胞内同时转染 miRNAmimics 和 psiCHECK-hsa_circ_000244,多功能酶标仪检测报告基因的表达水平,并筛选报告基因表达下调的 miRNAs(可能有多个,本例中假定选择 hsa-miR-301a-3p 进行后续研究)

4、miRNAs 靶基因预测与功能富集分析

对 hsa-miR-301a-3p 进行靶基因预测,结果如下:



通过功能富集分析将前列腺癌相关的基因筛选出来:


5、miRNAs 靶基因筛选、验证及相关功能研究
 (1)初筛:qPCR 验证上述靶基因在前列腺癌组织和癌旁组织中的表达量差异,筛选与 hsa_circ_000244 表达呈正相关的靶基因(本例中 hsa_circ_000244 在癌组织中表达较低,因此需要筛选在癌组织中表达量较低的靶基因);(2)进一步筛选:在前列腺癌细胞系中过表达 hsa_circ_000244(使用汉恒生物的超强成环系统 HBcirc-EnhancedTM circRNA 慢病毒或腺病毒工具),qPCR 验证上述靶基因表达水平。

汉恒生物 HBcirc-EnhancedTM circRNA 环化载体系统(图谱如下),上下游的成环元件经过精心设计、优化和验证,可以达到 100% 成环、表达倍数高的效果并可获得全长过表达 circRNA 的腺病毒,慢病毒或腺相关病毒,适用于各种细胞和动物模型。
 

 选择 hsa_circ_000244 过表达后,表达量也明显上调的靶基因作为研究对象,本例中假定为 PTEN 基因。查询 PTEN 的功能,发现它主要与细胞侵袭和迁移相关。(3)在前列腺癌细胞系中封闭 hsa-miR-301a-3p(使用汉恒生物的慢病毒或腺病毒工具),WB 和 qPCR 检测 PTEN 的表达水平;(4)在前列腺癌细胞系中封闭 hsa-miR-301a-3p(使用汉恒生物的慢病毒或腺病毒工具),通过细胞迁移和细胞侵袭等实验,确定 hsa-miR-301a-3p 对细胞功能的影响;(5)双荧光素酶报告基因实验:构建 PTEN 3’UTR 报告基因载体,将 hsa-miR-301a-3p mimics 与报告基因载体共转 293 T 工具细胞,多功能酶标仪检测报告基因的表达水平,阐明 hsa-miR-301a-3p 作用于 PTEN 的分子机制;注:为了实验的严谨性,可加入 PTEN 3’UTR 区 hsa-miR-301a-3p 预测结合区域的突变体作为对照,进一步说明问题。(6)前列腺癌细胞系中过表达 hsa_circ_000244,检测 hsa-miR-301a-3p 和 PTEN 的表达水平及细胞功能学研究:在前列腺癌细胞系中过表达 hsa_circ_000244(使用汉恒生物的成环系统 HB circ-EnhancedTMcircRNA 慢病毒或腺病毒工具),然后分别进行如下实验:1)WB 和 qPCR 检测 PTEN 表达水平;2)qPCR 检测 hsa-miR-301a-3p 表达水平;3)细胞迁移和细胞侵袭等实验,研究 hsa_circ_000244 对细胞功能的影响;

6、circRNA-miRNA-mRNA 调控网络的验证
汉恒生物-circRNA-miRNA-mRNA 调控机制研究解决方案:基于 ceRNA 作用方式和双荧光素酶报告基因实验,证明 circRNA 可 rescue 下游 miRNA 对其靶基因的抑制作用。
本实例的具体流程如下:
使用步骤 5(5)中构建的 PTEN 3’UTR 报告基因载体和步骤 5(2)中构建的 hsa_circ_000244 过表达载体,将两者共转至 293 T 工具细胞中,多功能酶标仪检测报告基因的表达水平,可间接证明 hsa_circ_000244 通过海绵吸附 hsa-miR-301a-3p,从而上调 PTEN 靶基因的表达。

注:为了实验的严谨性,可加入 PTEN 3’UTR 区 hsa-miR-301a-3p 预测结合区域的突变体作为对照,进一步说明问题。


参考文献

1、Circular RNAs:diversity of form and function. Lasda E, Parker R. RNA. 2014 Dec;20(12):1829-42.

2、Circular RNAs are alarge class of animal RNAs with regulatory potency. Memczak S, Jens M,Elefsinioti A, Torti F, Krueger J, Rybak A, Maier L, Mackowiak SD, GregersenLH, Munschauer M, Loewer A, Ziebold U, Landthaler M, Kocks C, le Noble F, RajewskyN. Nature. 2013 Mar21;495(7441):333-8. 

3、Circular RNA profilingreveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiplemiRNAs. Zheng Q, Bao C, Guo W, Li S, Chen J, Chen B, Luo Y, Lyu D, Li Y, Shi G,Liang L, Gu J, He X, Huang S.NatCommun. 2016Apr 6;7:11215.

4、Circular RNA Related tothe Chondrocyte ECM Regulates MMP13 Expression by Functioning as a MiR-136'Sponge' in Human Cartilage Degradation. Liu Q, Zhang X, Hu X, Dai L, Fu X,Zhang J, Ao Y. Sci Rep. 2016 Mar2;6:22572. D

上一篇

萤光素酶检测原理及研究应用

下一篇

Mfn2靶向出击线粒体动力学,糖尿病心肌病治疗大转机

更多资讯

询价列表

暂时没有已询价产品

inquiry icon 快捷询价
    当你希望让更多商家联系你时,可以勾选后发送询价,平台会将你的询价消息推荐给更多商家。
    个人名片

    编辑个人名片

    编辑
    yanxuan

    关注「丁香通研选」

    微信及时获得商家回复,

    获得更多交易信息和保障。