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【干货分享】如何设计 siRNA

人阅读 发布时间:2019-12-06 09:50

自 1998 年 Fire 和 Mello 首次提出 RNAi(RNA interference,RNA 干扰)概念以来,越来越多的人开始重视小 RNA 的研究,之后 RNAi 在基因功能的研究中也得到广泛应用。RNAi 是一种存在于真核生物中的转录后基因沉默现象,在生物进化过程中能够抵御病毒感染及防止基因组中由于逆转座子元件扩增引起的不稳定。

在 miRNA(microRNA)、siRNA(small interfering RNA)等小 RNA 的介导下,RNAi 能够特异性地调控 mRNA 基因在表观遗传学水平、转录水平及转录后水平的表达。


如何设计 siRNA?

小干扰 RNA(Small interfering RNA;siRNA)与靶向特异性的 mRNA 结合,通过 RNA 介导的沉默复合体 RISC(RNA-induce siliencing complex)介导 mRNA 的降解。siRNA 长度一般为 21-23nt,被 RISC 识别结合之后,siRNA 发生解旋。RISC 在 siRNA 的反义链指导下,寻找具有同源序列的内源性的 mRNA,并在距离 5′ 端 10-11 位碱基之间切割 mRNA,从而导致转录后基因沉默。

siRNA 设计原则

RNAi 最终要通过 siRNA 片段与靶基因结合并使之降解,因此,确保高度同源于靶基因而绝无与其他基因同源的 siRNA 序列,是决定 RNAi 特异性的关键所在,也是 siRNA 设计的基本原则。从具有不同沉默效率的 siRNA 序列中筛选出高效的 siRNA 序列,需要经过严密的设计和不断的实验检验。下面我们就来看下 siRNA 设计要遵循哪些原则:

1. siRNA 序列在靶基因中的位置

从靶基因起始密码子 AUG 下游 50~100 个核苷酸开始搜寻理想的 siRNA 序列,越靠近靶基因的 3′ 端,其基因沉默效果可能越好。

2. siRNA 序列的起始碱基与长度

SiRNA 序列最好为 AA(N n)UU(N 代表任意碱基;n 为碱基数目,在 19~29 nt 之间), NA(N n)UU 和 NA(N n)NN 序列也可以。最新研究表明 ,27 nt 或 29 nt 的 siRNA 与 21 nt siRNA 相比 27 nt SiRNA 对靶基因的最大抑制率可在相对低的浓度下得到。

3. siRNA 3′端突出碱基的选择

建议用 dTdT 取代 3′ 端的 2 个碱基突出,增强 siRNA 双链复合体的稳定性。

4. siRNA 序列中 G/C 含量的选择

G/C 含量在 30%~52% 的 siRNA 序列,其沉默基因效果较好。


5. siRNA 中应避免连续的单一碱基和反向重复序列

因为连续 2 个以上的 G 和 C 可以降低双链 RNA 的内在稳定性,从而抑制 RNAi 作用;连续 3 个以上的 U 和 A 可能终止由 RNA Polymerase III 介导的转录。siRNA 序列中的重复序列或回文结构可能形成发夹状结构,这种结构的存在可以降低 siRNA 的有效浓度和沉默效率。

6. siRNA 双链的内在稳定性

反义链 5′ 端的第一个碱基尽量为 A 或 U;siRNA 正义链的 5′ 端第一个碱基尽量为 G 或 C。

7. siRNA 正义链的碱基偏爱性

正义链的第一位和第十九位碱基为 A;正义链的第十位碱基为 U;正义链的第十三位碱基不为 G;正义链的第十九位碱基不为 G 或 C 时,siRNA 序列具有较高的基因沉默效率。

8. siRNA 序列的特异性

目前没有发现 siRNA 的干扰效率与 mRNA 中具体位置的关系,为确保对靶 mRNA 的有效抑制,针对每一个靶基因结合上述 siRNA 设计原则选择靶点相差 25bp 以上的 4 星半以上的至少 3 条序列。


siRNA 设计步骤

首先在 NCBI 上找到靶基因的目的片段,如果靶基因有多个转录本就需要把所有 NM 号所对应的 CDS 序列放在 clone Manager 中比对,并选择拥有序列 CCDS 进行设计。 siRNA 有很多在线设计工具。下面列出了 4 个 siRNA 设计,我们以小鼠的 Map2k1 在 thermofisher 上设计 siRNA 为例。

siDirect 设计网站  http://sidirect2.rnai.jp

DSIR 设计网站  http://biodev.extra.cea.fr/DSIR/DSIR.html

invivogen 设计网站  http://www.invivogen.com/sirnawizard/siRNA.php

thermofisher 设计网站  https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/setOption.do?designO

我们通过 NCBI 找到小鼠 Map2k1 有一个转录本 NM_008927.4,将 NM 号或者 CDS 序列复制到 thermofisher 网站中,如下图所示。





 

目前没有发现 siRNA 的干扰效率与 mRNA 中具体位置的关系,为确保对靶 mRNA 的有效抑制,针对每一个靶基因结合上述 siRNA 设计原则选择靶点相差 25bp 以上的 4 星半以上的至少 3 条序列。随后将 siRNA 片段进行 Blast 分析,尽量选择与靶基因特异结合的序列,进行化学合成后,通过实验筛选出沉默效率最高的 siRNA 序列进行下一步的基因功能研究。


PS: 需要注意的是,有的 siRNA 序列在设计时没有遵守这些指导方针,实验证明也具有很高的干扰效应,这表明,我们只能根据上述指导方针设计出理论上具有较高沉默效应的 siRNA 序列,siRNA 的最终活性需要用实验来验证 。

小片段 RNA 如何进行转染呢?

目前市面上大多数转染试剂都是针对比较大的质粒 DNA 而非小 RNA 分子。但是转染 DNA 的转染试剂和方法不完全适用于转染 siRNA、miRNA 等小片段 RNA。

并且 siRNA 转染比 DNA 转染对转染试剂细胞毒性的要求更严格。对于以研究基因干扰为主的 RNAi 实验来说,因为细胞死亡和 RNAi 实验造成的结果在现象上是一致的,轻则影响实验数据,重则改变实验结果。

因此 RNA 干扰实验首先要求选择适合转染小 RNA 的高效转染试剂,其次要求转染试剂本身的细胞毒性很小,比如选择汉恒生物 RNA 专用转染试剂 ——RNAFit。

 


在绝大多数的细胞(如 HeLa,MCF7 或 NIH-3T3)中使用 RNAFit 转染 1 nM siRNA,就能达到超过 90% 的转染效率;对于难以转染的悬浮细胞系如 K562 或 THP-1 细胞,使用 RNAFit 转染终浓度为 5 nM 的 siRNA,也可以观察到超过 80% 的转染效率。

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